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• W1489134246 abstract "L’infertilite affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans pres de la moitie des cas, des facteurs masculins sont a la base de l’infertilite, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoides de mammiferes subissent une serie d’etapes de maturation avant d’acquerir la capacite de feconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu a l’interieur de l’epididyme, ou les spermatozoides gagnent la capacite de se mouvoir ainsi que de reconnaitre et d’interagir avec l’ovocyte. Suite a l’ejaculation, ils doivent subir une seconde serie de modifications a l’interieur du tractus genital femelle, nommee capacitation. Nous avons prealablement demontre que chez le bovin, la famille de proteines BSP (Binder of SPerm) est essentielle a la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi ete isoles du fluide seminal de porc, de bouc, de belier, de bison et d’etalon. Malgre la detection d’antigenes apparentes aux BSP dans le fluide seminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais ete caracterises chez ces especes. Nous avons emis l’hypothese que des homologues des BSP seraient exprimes chez la souris et l’humain et joueraient un role dans la maturation des spermatozoides. Nous avons demontre que des sequences homologues aux BSP sont presentes dans les genomes murin et humain. Le genome murin contient trois sequences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule sequence (BSPH1) a ete identifee chez l’humain. Les sequences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont ete clonees, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogene. Les trois genes sont exprimes uniquement dans l’epididyme et font partie d’une sous-famille distincte a l’interieur de la famille des BSP. Chez les ongules, les BSP sont exprimees par les vesicules seminales, sont ajoutees aux spermatozoides lors de l’ejaculation et representent une proportion significative des proteines du plasma seminal. Au contraire, les BSP epididymaires ne sont retrouvees qu’en faibles quantites dans le fluide seminal. L’etude de leur role dans les fonctions spermatiques etait donc plus difficile que chez les ongules, ou l’isolement des proteines natives du plasma seminal a l’aide de techniques de chromatographie etait possible. Afin d’etudier sa fonction, nous avons exprime BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caracteristiques de ces proteines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnee a une etiquette hexahistidine ou glutathion-S-transferase a donne lieu a des proteines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a ete possible grâce a l’ajout d’une etiquette thioredoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a ete purifiee par affinite et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoproteines de faible densite et la membrane des spermatozoides, suggerait que la proteine recombinante possedait sa conformation native et pouvait etre utilisee pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a ete detectee dans le plasma seminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native a une colonne d’affinite a l’heparine a indique qu’elle partage aussi cette propriete de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables a l’heparine du tractus genital feminin. Une colonne d’immunoaffinite anti-BSPH1 a ete preparee a l’aide d’anticorps generes contre des proteines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native a partir d’extraits de spermatozoides humains. Nos resultats montrent que BSPH1 native serait localisee dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moleculaire apparente etait de 32 kDa, ce qui est superieur a la masse predite selon sa sequence en acides amines, indiquant la presence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilite, la viabilite et la capacitation a aussi ete etudie. Les deux dernieres variables ont ete mesurees par un essai de cytometrie en flux, optimise dans cette etude. Aucun effet des proteines recombinantes ou des anticorps sur la motilite et la viabilite des spermatozoides n’a ete note. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait ete observee a la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus elevees n’ont pas montre d’effet. De la meme maniere, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces resultats suggerent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de facon marquee. Cependant, puisque BSPH1 native possede probablement des modifications post-traductionnelles, une proteine recombinante produite dans des cellules de mammiferes pourrait affecter les fonctions spermatiques. De maniere alternative, les BSP epididymaires remplissent peut-etre un role different dans les fonctions spermatiques que celles secretees par les vesicules seminales des ongules. Les resultats decrits dans cette these pourraient contribuer a ameliorer le diagnostic de l’infertilite masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistee et eventuellement, pourraient mener au developpement de contraceptifs masculins." @default.
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