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• W1550125539 abstract "Trotz enormer Verbesserungen der Lebensqualitat und -erwartung ist eine Heilung der HIV-Infektion durch die kombinierte antiretrovirale Therapie (cART) nicht moglich. Die dauer-hafte Einnahme der Wirkstoffe fuhrt zwar zu einem Wiederanstieg der CD4+-T-Zellzahl und zu einer Reduktion der Viruslast, eine vollstandige Eradikation der Reservoirs wird aber nicht erreicht. Zusatzlich ist cART mit Nebenwirkungen und Langzeittoxizitaten verbunden. Die Gentherapie stellt eine vielversprechende, potentiell kurative Behandlungsoption fur die HIV-Infektion dar. Lentivirale Vektoren (LVV) gelten als interessante Option fur die effiziente und stabile genetische Modifikation mit therapeutischen Genen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung lentiviraler Vektoren fur die HIV-Gentherapie.Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob humane primare B-Zellen sich als korpereigene „Fabriken“ fur antivirale Wirkstoffe eignen. Hierfur wurde ein Protokoll fur die effiziente Transduktion von B-Lymphozyten mit lentiviralen Partikeln etabliert, die mit den Glykoproteinen des Gibbon ape leukemia virus (GALV) pseudotypisiert waren. Dieses zeichnet sich im Vergleich zu existierenden Protokollen durch eine schonende Prozedur und deutlich hohere Ausbeuten transduzierter Zellen aus. Der Einbau einer B-Zell-spezifischen enhancer-Kassette vor dem hier verwendeten Promotor des Spleen Focus Forming Virus konnte zudem zu signifikanten Expressionssteigerungen in den Zielzellen fuhren. Zugleich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der potentielle Therapiekandidat sC46 (ein HIV-Eintrittsinhibitor) von primaren Zellen nicht effizient sezerniert wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein lentivirales System fur den Transport von Designer-Nukleasen entwickelt. Diese sequenzspezifischen Nukleasen konnen resistenzvermittelnde Mutationen (z.B. der Knock-out des HIV-Korezeptors CCR5) induzieren. Der Transport der hier verwendeten TAL-Effektor-Nukleasen (TALEN) war aber aufgrund ihrer Struktur bislang problematisch. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass angesichts repetitiver Sequenzen der Transport uber revers transkribierende lentivirale Systeme nicht moglich ist. Die Herstellung einer enzymatisch inaktiven reversen Transkriptase gestattete jedoch die direkte Tanslation der viralen RNA in der Zielzelle. Die Einfuhrung einer internen ribosomalen Eintrittsstelle und eines starken Polyadenylierungssignals in die hier entwickelten nicht-revers transkribierenden lentiviralen Vektoren (NRTLV) resultierte zusatzlich in einer deutlich verstarkten Expression. In Kombination mit optimierten Kulturbedingungen war es so erstmals moglich, TALEN uber Lentiviren zu transportieren. Im Gegensatz zu DNA-basierten Vektoren ist durch das hier entwickelte System zusatzlich das Risiko der Insertionsmutagenese minimiert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Vektorsysteme entwickelt, deren Anwen-dung nicht auf die HIV-Gentherapie beschrankt ist. Sie konnten unter anderem bei der Expression anderer therapeutischer Proteine in B-Zellen bzw. bei der transienten Expression problematischer (repetitiver, toxischer etc.) Transgene eingesetzt werden. Although the combined antiretroviral therapy (cART) has markedly improved prognosis and quality of life of HIV-patients, it does not constitute a cure. Moreover, the lifelong application of antiviral drugs has been associated with adverse effects due to drug-related toxicities. Therefore, gene therapy has been considered as a promising alternative.Lentiviral vectors (LVV) have been established as high-efficiency gene transfer vehicles for a large number of target cells, namely primary cells. Moreover, their relatively well established safety profile makes LVV an attractive choice for gene therapy applications.The goal of the first part of this work was to develop a strategy to use B lymphocytes for the delivery of antiviral proteins or peptides. It was shown that pseudotyping of LVV with glycoproteins of the Gibbon ape leukaemia virus (GALV) resulted in high titres and efficient transduction. Furthermore, when compared to the currently favoured glycoproteins of measles virus (MV) it revealed a significantly improved total yield of transduced cells for the protocol established here. Additionally, the combination of a B-cell specific enhancer with the spleen focus forming virus promoter (SFFV) resulted in a considerably higher transgene expression in primary human B cells. The present work also showed that secretion of the potential therapeutic gene sC46 by various primary cells is highly inefficient. The goal of the second part of this study was to develop a lentiviral system for the efficient delivery of designer nucleases. Transient expression of sequence-specific designer nucleases (e.g., TAL effector nucleases (TALENs)) is an attractive option to induce knock-outs in vitro and in future gene therapy applications. In fact, knock-out of the receptor CCR5 can lead to a resistance towards HIV. However, to date lentiviral delivery of TALENs has not been feasible. The present work revealed that this was due to multiple recombination events during reverse transcription induced by the repetitive structure of TALEN-genes. To overcome this problem, novel non-reverse transcribable lentiviral vectors (NRTLV) with an enzymatically inactive reverse transcriptase were developed. Thus a novel lentiviral system based on RNA-delivery was established that circumvents the problem of recombination of repetitive sequences. Inclusion of RNA elements (internal ribosome entry site and polyadenylation signals) resulted in significantly improved expression levels. After optimising the culture conditions, it could for the first time be shown that TALEN delivery by lentiviral vectors is indeed possible. Importantly, this is a purely RNA-based system avoiding the risk of insertional mutagenesis.In conclusion, two lentiviral vector systems were successfully established, the potential applications of which are not solely limited to HIV gene therapy. In fact, B cells represent interesting vehicles for the expression of various therapeutic genes, while NRTLV should be useful for the transient expression of a variety of “problematic” (repetitive, toxic etc.) transgenes." @default.
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