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• W1566259154 abstract "espanolRotavirus es el principal agente causante de gastroenteritis viral en ninos y animales jovenes en todo el mundo. Una de las principales proteinas de rotavirus es la glicoproteina no estructural 4 (NSP4) que juega un papel crucial tanto en el ciclo replicativo de rotavirus, actuando como receptor de particulas inmaduras en el reticulo endoplasmatico, como en la fisiopatologia de rotavirus, siendo la primera enterotoxina de origen virico descrita hasta el momento. El objetivo de la presente tesis fue clonar y producir la glicoproteina NSP4 de diferentes cepas humanas y animales de rotavirus para asi poder realizar estudios inmunogenicos tales como la caracterizacion de epitopos presentes en la proteina y la respuesta inmune que esta proteina despierta tras la infeccion por rotavirus. Asi mismo nos planteabamos estudiar la capacidad que poseen tanto la infeccion por rotavirus como la proteina NSP4 de producir oxido nitrico (ON) tanto in vivo como in vitro y la posible implicacion del ON en la fisiopatologia de rotavirus. Se utilizo el sistema de expresion de baculovirus en celulas de insecto para la produccion y purificacion de la proteina NSP4 de diferentes cepas de rotavirus humanas y de animales en forma biologicamente activa. Experimentos de inmunizacion de ratones demostraron que los anticuerpos producidos frente a la proteina NSP4 reconocen principalmente el fragmento carboxi-terminal de la proteina (aminoacidos 114 a 175), por lo que esta region es inmunodominante. En la presente tesis se utilizo la tecnologia de phage display para producir anticuerpos monoclonales de simple cadena (scFv) frente a la proteina NSP4. Esta tecnica nos permitio aislar scFvs frente a regiones no inmunodominantes de la proteina NSP4. Los estudios realizados con sueros de ninos convalecientes de una infeccion por rotavirus muestran que la proteina NSP4 provoca una respuesta inmune humoral tras la infeccion natural por rotavirus en ninos, constituida por anticuerpos sericos de clase IgG y que esta respuesta no parece ser de larga duracion, segun los resultados obtenidos con sueros de ninos y adultos sanos. Proteinas NSP4 procedentes de dos diferentes genotipos (A y B) fueron utilizadas para estudiar la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a NSP4. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos IgG sericos desarrollados frente a NSP4 en ninos con gastroenteritis aguda por rotavirus presentan en el 40% de los casos estudiados reactividad cruzada frente a mas de un genotipo de dicha proteina, por lo que este reconocimento de los genotipos A y B de NSP4 no es siempre heterotipico. Los experimentos realizados con celulas epiteliales humanas HT-29 in vitro muestran que la proteina NSP4 provoca un incremento de la secrecion de ON en este tipo celular. Este incremento ocurre de forma paralela al incremento de calcio intracelular observado en la misma linea celular en respuesta a NSP4, indicando una posible participacion de la enzima oxido nitrico sintasa constitutiva (cNOS). Por ultimo los experimentos realizados in vivo en el modelo murino, asi como en muestras de orina procedentes de ninos con gastroenteritis por rotavirus muestran que las infecciones por rotavirus en ratones Balb/c provocan un aumento en la concentracion de los productos derivados del ON en la orina de los animales infectados, con la participacion de la enzima oxido nitrico sintasa inducible (iNOS) en el modelo murino y que este incremento se observa tambien en la orina de ninos con gastroenteritis por rotavirus. __________________________________________________________________________________________________ EnglishThe baculovirus expression system in insect cells was utilized to produce and purify the biologically active form of the NSP4 protein from rotavirus strains isolated from different animal and human strains. After the immunization of mice with the different ourified NSP4 proteins the super-immune sera obtained from NSP4 immunized mice, strongly recognize the carboxi-end of the protein (aminoacids 114 to 175), being indicative of the immunodominance of this region. One of the objebtives of this thesis was to obtain monoclonal antibodies, using the phage display technique that showed to be a useful tool in producing antibodies that recognize different epitopes in the NSP4 protein, thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. One interesting result when using this technique was that the phage display technique allowed us for the isolation of single chain monoclonal antibodies against non-immunodominant regions of NSP4. We also present data on the immunogenicity of the NSP4 protein in natural rotavirus infections in humans. Our results show that the NSP4 protein elicits a humoral immune response in children that had been naturally infected by rotavirus. The IgG serical antibodies developed against the NSP4 in children suffering acute rotavirus gastroenteritis, present cross reactivity against more than one genotype of the protein in 40% of the studied cases, indicating that the recognition of A and B NSP4 genotypes is not always heterotypic. Finally we studied the possible role of the nitric oxide (NO) in rotavirus pathophysiology. The NSP4 protein produced an increase in NO secretion in cultured HT-29 human epithelial cells. This increase occurred in parallel to the intracellular calcium increase previously observed in the same cell line in response to the NSP4. The rotaviral infections in Blab/c mice produced an increase in the concentration of the nitric oxide derived products in the urine of the infected animals, through the induction of the inducible nitric oxide enzyme (iNOS) in the murine model. This increase was also observed in the urine of children suffering acute rotaviral gastroenteritis." @default.
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