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• W1615728951 abstract "In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen Saugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthalt eine HR-Kassette mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele konnen nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden, dessen zellulare Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen, biochemischen und zellularen Analyse zu etablieren. Das pGrec-HR-Messystem wurde an zwei isogenen Zellparchen angewendet. Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al., 2002)) konnte die vermutete Storung der HR in den Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso scheint die Rate der homologen Rekombination in Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden, deren Storung mit der Mutagenuberempfindlichkeit (MMS) und chromosomalen Instabilitat von CL-V4B-Zellen korreliert. Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996). Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche Einflusse der Chromatinstruktur an einem spezifischen Integrationsort zu umgehen. Das Zellparchen AT-pEBS (Atm(-/-), transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der fur humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert. Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen statistisch signifikant erhoht (34 - 43-fach). Somit ware erstmals eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch, dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen erhoht zu sein scheint (6-fach). Mogliche Grunde fur die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen Ansatzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert.Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert und somit prinzipiell in allen Saugerzellen anwendbar. Insgesamt stellt pGrec also ein sehr sensitives und nutzliches Werkzeug zur Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer und zellularer Ebene dar." @default.
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