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• W1696111016 abstract "Obtaining X-ray suitable crystals is to date the rate limiting step to solve the structure of biological macromolecules such as proteins at atomic resolution. Those Structures are required for the design of novel drugs and to understand the way biological systems work. Rationalization of crystallization by biophysical methods is a promising way to accelerate this process. Here Dynamic Light Scattering (DLS) was applied in order to develop novel methods for the rationalization of crystallization and to analyze crystallization and aggregation of proteins in detail.The method of in situ DLS was successfully applied to all major crystallization methods used today. For the first time ever the submicroscopic processes during crystallization and nucleation could be observed within thin capillaries used in the Granada Crystallization Box Domino (GCB-D) and in the CrystalFormer HT. Furthermore for the first time DLS measurements could be carried out in small protein and crystallization droplets under oil in Terazaki plates. In this case not only the observation and scoring of the crystallization or oligomerization processes is possible, also the quality of the DLS measurements is good enough that in future optical cuvettes may be replaced by Terazaki plates, thus saving time and material. 1 µL sample solution instead of 10 µL can be used and automated measurements are possible. Also light scattering measurements in the most commonly used 96 well sitting drop vapor diffusion plates could be improved and detailed analysis and scoring of crystallization processes within these plates was enabled and demonstrated. Automation of measurements for the above mentioned crystallization environments and methods could be automated for the first time. This allows analyzing up to 192 droplets at the same time. Some of these results are published already.Following these improvements, DLS measurements were carried out also for the first time in special environments, as a crystallization box used for microgravity experiments in space or in cubic lipid phases within PCR tubes. Especially the latter set up is valuable, since membrane proteins are mainly crystallized within cubic lipid phases today. Based on the developed DLS methods and technical results obtained, DLS was applied to investigate the crystallization behavior of the surface layer protein SlfB from Lysinibacillus spaericus. Applying DLS initial crystals could be obtained from this protein. Moreover it could be shown by DLS that the stability of SlfB depends on the presence of bivalent cations. At pH 4.75 and 7.4 the protein is stabilized by 100 mM of either MgCl2 or SrCl2. This information will support crystallization experiments to obtain X-ray suitable crystals and thus will facilitate the 3D structure analysis. It could be confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) that the elongated shape of SlfB predicted by DLS is indeed the shape of the protein.Furthermore in situ DLS was applied to investigate the specific interaction of the human membrane proteins CD81 and Claudin-1, both involved in the infection of liver cells by hepatitis C virus (HCV). It could be shown by DLS that only at a CD81:Claudin ratio of 7:3 and in the presence of cholesteryl hemisuccinate a stable complex is formed. Based on these results and biochemical data a model for this complex was proposed. Finally CD81 could be crystallized after solution conditions were improved by applying in situ DLS. Die Gewinnung Rontgentauglicher Kristalle ist heute der limitierende Schritt bei der Losung der Struktur von biologischen Makromolekulen, zum Beispiel Proteinen, bei atomarer Auflosung. Diese Strukturen werden benotigt um neue Medikamente zu entwickeln und um zu verstehen wie biologische Systeme funktionieren. Die Rationalisierung der Kristallisation unter Anwendung biophysikalischer Methoden ist ein viel versprechender Weg diesen Prozess zu beschleunigen. In dieser Arbeit wurde Dynamische Lichtstreuung (DLS) angewendet um neue Methoden der Rationalisierung der Kristallisation zu entwickeln und die Prozesse der Proteinkristallisation und –aggregation im Detail zu untersuchen.Die Methode der Dynamischen Lichtstreuung in situ wurde erfolgreich an alle heute gebrauchlichen Kristallisationsmethoden adaptiert. Zum ersten Mal uberhaupt konnten die submikroskopischen Prozesse wahrend der Kristallisation in Kappilaren der auf Gegendiffusion basierenden Granada Crystallization Box Domino (GCB-D) und dem CrystalFormer HT zeitaufgelost untersucht werden. Weiterhin konnten erstmals DLS Messungen in kleinen Protein- und Kristallisations-Tropfen unter Ol in sogenannten Terazaki Platten durchgefuhrt werden. In diesem Fall ist nicht nur die Uberwachung von Kristallisations- oder Oligomerisierungs Prozessen moglich sondern die hervorragende Qualitat dieser Messungen ermoglicht es die bislang uberwiegend fur DLS Messungen genutzten Kuvetten in Zukunft durch Terazaki-Platten zu ersetzen. Dies spart Zeit und Material. Es reichen fur eine Messung 1 µL statt bislang 10 µL Losung. Weiterhin lassen sich die Messungen auch voll, automatisch und zeitaufgelost in unterschiedlichen Tropfen parallel durchfuhren.. Lichtstreumessungen wurden auch in Tropfen mit niedrigen Volumen in Platten mit 96 Kristallisationstopfen durchgefuhrt. Diese Platten sind heute die meistgenutzten in robotunterstutzten Hochdurchsatz Kristallisationsexperimenten. Die Methode der in situ DLS Messung in diesen Platten wurde ausgearbeitet und angepasst. Eine detaillierte Analyse von Kristallisationsphanomenen in diesen Platten wurde ermoglicht und an ausgewahlten Beispielen dargestellt. Diese Anwendung ermoglicht es nun bis zu 192 Kristallisationsexperimente uber DLS zu uberwachen und auszuwerten. Ein Teil dieser Arbeiten konnte bereits veroffentlicht werden.Im Anschluss an diese Experimente und Arbeiten konnte gezeigt werden, dass DLS Messungen auch in einigen besonderen Kristallisationsumgebungen moglich sind. So zum Beispiel in Kapillaren in einer Kristallisationsbox fur Weltraumexperimente oder in kubisch lipiden Phasen in PCR-Behaltern. Vor allem die letztere Kristallisationsumgebung gewinnt heute zunehmend an Bedeutung, da Membran-Proteine haufig in kubisch lipiden Phasen kristallisiert werden. Es ist nun im Prinzip moglich die submikroskopischen Vorgange von kristallisierenden Membran-Protein Losungen in kubisch lipiden Phasen mit DLS zu untersuchen und zu optimieren. Damit lasst sich die Kristallisation und die Strukturaufklarung dieser sehr wichtigen Protein-Klasse zukunftig verbessernBasierend auf den vorab beschriebenen und im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Methoden wurde in situ DLS angewandt um das surface layer protein SlfB aus Lysinibacillus spaericus in Losung zu analysieren. Die uber DLS gesammelten Informationen ermoglichten eine erste erfolgreichen Kristallisation dieses Proteins. Zusatzlich konnte mit DLS gezeigt werden, dass die Stabilitat von SlfB uber die Zugabe von bivalenten Kationen optimiert werden kann. Bei pH-Werten von 4.75 und 7.4 wird das Protein durch 100 mM MgCl2 oder SrCl2 am starksten stabilisiert. Dieses Erkenntnisse sollen in Zukunft genutzt werden, um rontgentaugliche Kristalle von SlfB zu erhalten und folgend die Struktur zu losen. Durch Kleinwinkel Rontgenbeugung konnte gezeigt werden, dass die anhand von DLS Messungen bereits vermutete langliche Form von SlfB tatsachlich in Losung vorliegt.Des Weiteren wurde in situ DLS angewandt, um die spezifische Interaktion von CD81 und Claudin-1, beides menschliche Membran-Proteine, die an der Infektion von Leberzellen mit dem Hepatitis C Virus (HCV) beteiligt sind, zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nur bei einem Verhaltnis von CD81 zu Claudin-1 von sieben zu drei und unter Zugabe von von Cholesteryl Hemisuccinat ein stabiler und definierter Komplex gebildet wird. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ein Modell fur einen moglichen CD81-Claudin-1 Komplex vorgeschlagen werden. Abschliesend konnte CD81 alleine kristallisiert werden, nachdem die Proteinlosung basierend DLS Messungen optimiert wurde." @default.
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