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- W195416996 abstract "Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden (i) Untersuchungen zur Bildung und Identifizierung Wolfram- sowie Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus, und (ii) Untersuchungen zur Biosynthese des Eisen-Molybdan-Cofaktors der konventionellen Mo-abhangigen Nitrogenase des gleichen Organismus durchgefuhrt.Voruntersuchungen zum Einfluss von WO4 2-, ReO4 - und MoO4 2- auf die Nitrogenaseaktivitat (C2H2-Reduktion) ergaben, dass MoO4 2- die Aktivitat der Nitrogenase stimuliert, wahrend WO4 2- die C2H2-Reduktion inhibiert. Mit ReO4 - konnte kein Einfluss auf die Nitrogenaseaktivitat beobachtet werden, da ReO4 - - im Gegensatz zu MoO4 2- - nicht von den Zellen aufgenommen und somit keine Re-haltige Nitrogenase in-vivo erzeugt wurde. Eine W-haltige Nitrogenase konnte nach der Kultivierung einer anfA- -Mutante von R. capsulatus in Mo-defizientem Nahrmedium in Gegenwart von WO4 2- (1 mM) isoliert und chromatographisch partiell gereinigt werden. Das isolierte Protein, in welches durchschnittlich 1 (± 0,15) W-, 16 (± 2) Fe- und 0,01 Mo-Zentren pro Protein-Tetramer eingebaut wurden (Hinweis auf die Insertion von einem FeW-Cofaktor- und einem P-Clustermolekul pro Tetramer), zeichnete sich durch eine marginale Aktivitat aus. Durch detaillierte EPR-spektroskopische Charakterisierung des W-haltigen Proteins konnte ein S = 3/2-Signal (g = 4,19, 3,93, 2,01) eindeutig dem FeW-Cofaktor zugeordnet und somit der Einbau von Wolfram in den Cofaktor bewiesen werden. Die W-haltige Nitrogenase konnte nicht enzymatisch (in Gegenwart des Fe-Proteins) reduziert, d.h. in den Turnover-Zustand uberfuhrt werden und ist daher nicht bzw. allenfalls minimal aktiv. Im Zuge von Redoxtitrationen konnte gezeigt werden, dass der FeWco ein um mindestens 150 mV niedrigeres Halbstufenpotential besitzt als der FeMo-Cofaktor. Im Fall der P-Cluster konnte kein signifikanter Unterschied bzgl. der Potentialabhangigkeit zwischen dem P-Cluster der W-haltigen Nitrogenase und dem des nativen Enzyms beobachtet werden.Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors der konventionellen Nitrogenase mit einer nifE- -Mutante von R. capsulatus durchgefuhrt. Das Genprodukt von nifE ist in die Biosynthese des Cofaktors involviert. Im Laufe dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass nifE- -Zellen in der Lage sind - wenn auch mit geringerer Rate als Wildtypzellen - diazotroph zu wachsen und C2H2 nicht nur zu C2H4, sondern auch zu C2H6 zu reduzieren. Anhand von Untersuchungen an nifE- -Zellen konnte weiterhin gezeigt werden, dass (i) die in-vivo-Aktivitat eine fur die konventionelle Nitrogenase ungewohnliche Abhangigkeit von der MoO4 2- -Konzentration im Nahrmedium (maximale Aktivitat mit 20 - 50 µM MoO4 2-) zeigt, (ii) diese jedoch nicht von der alternativen Nitrogenase von R. capsulatus herruhrt, (iii) die gegenuber Wildtypzellen geringe Aktivitat (5 - 15 v.H.) auf der verminderten Bildung des MoFe-Proteins beruht, (iv) die Bildung von C2H6 aus C2H2 im Extrakt von nifE- -Zellen deutlich geringer ist (ca. 1/10) als die mit ganzen Zellen gemessene. Das MoFe-Protein konnte als intaktes [alpha]2[beta]2-Tetramer isoliert (Einbau von 1,7 (± 0,2) Mo-Zentren) und der FeMoco eindeutig EPR-spektroskopisch identifiziert werden. Anhand von vergleichenden EPR-spektroskopischen Untersuchungen mit nifE- - und Wildtypzellen konnte demonstriert werden, dass sich der FeMoco in ganzen nifE- -Zellen signifikant von dem unterscheidet, der sich im Extrakt- bzw. gereinigten Protein befindet. Auf der Basis samtlicher Ergebnisse wird ein Modell fur die Cofaktor-Biosynthese vorgeschlagen." @default.
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