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- W2023391110 abstract "The binding of rhBMP-2 to its receptors, the signal transduction cascade and the final responses of bone cells, osteoprogenitor cells and derived cell lines is of high fundamental and clinical interest. In this report concentration-response curves of the osteoblast cell line MC3T3-E1 under influence of rhBMP-2 was investigated. The biological response of the cells (corresponding to a down-stream effect of the receptor state-function) was monitored in pilot experiments by the MC3T3-cell alkaline phosphatase-induction test (MC3T3-cell ALP-induction test). It is shown that the MC3T3-cell ALP-induction test is a good tool for measuring biologically active recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) in crude extracts of E. coli as well as in highly purified form. In addition this test is very sensitive to chemically induced structural changes of rhBMP-2 such as those resulting from a radiolabeling of rhBMP-2 by the Bolton-Hunter procedure. The latter procedure reduces the biological activity of rhBMP-2 by a factor of 3–4. The measured concentration-response curves could all be non-linearly fitted to a rectangular hyperbola. The half-maximal saturation, K0.5, is found between 30–100 nM rhBMP-2 (= 0.8–2.5 μg/ml). The effect of rhBMP-2 shows a plateau i.e. maximal response at ca. 300–1000 nM rhBMP-2 (= 8–25 μg/ml). The data thus indicate a non-cooperative binding-response behavior. This was unexpected since BMP-2 binds simultaneously to two cooperating receptors of type 1 and type 2. However in the very low concentration range of employed rhBMP-2 a variable response of the cells was measured so that a full exclusion of cooperativity cannot be concluded at the present time. This will be clarified by future experiments. Die Bindung von rhBMP-2 an Rezeptoren intakter MC3T3-E1 Zellen und die Frage der Kooperativität Die Bindung von rhBMP-2 an Zellrezeptoren, die folgende Signaltransduktionskaskade und die endgültige Zellantwort von Knochenzellen, Knochenvorläuferzellen und abgeleiteten Zellinien ist von großem grundlegendem und klinischem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Konzentrations-Wirkungs-Verhalten der Osteoblastenzellinie MC3T3-E1 auf rhBMP-2 untersucht. Die biologische Antwort der Zellen (die einem „down-stream“ Effekt der Rezeptorzustandsfunktion darstellt) wurde in Pilotexperimenten durch eine Messung der Induktion der intrazellulären alkalischen Phosphatase (MC3T3-ALP-Induktionstest) aufgenommen. Es wird gezeigt, daß der MC3T3-ALP-Induktionstest ein zuverlässiges Werkzeug für die Messung der biologischen Aktivität von humanem gentechnisch hergestelltem rhBMP2 sowohl in E. coli Extrakten als auch in hochgereinigter Form darstellt. Der Test ist ebenfalls sehr gut dazu geeignet Strukturänderungen von rhBMP-2 z. B. nach Radiojodierung durch das Bolton-Hunter Reagenz zu erfassen. Letztere Methode reduziert die biologische Aktivität von rhBMP-2 um den Faktor 3–4. Die gemessenen Konzentrations-Wirkungskurven konnten nicht-linear an eine klassische Hyperbelfunktion angepaßt werden. Die halb-maximale Sättigung, K0.5, liegt zwischen 30–100 nM rhBMP-2 (= 0.8–2.5 μg/ml). Der Effekt von rhBMP-2 geht bei 300-1000 nM rhBMP-2 (= 8–25 μg/ml) in ein Plateau (maximale Zellantwort) über. Somit weisen unsere Daten auf ein nicht-kooperatives Bindungsverhalten von rhBMP-2 an den Rezeptor hin. Das war unerwartet, da die Bindung von BMP-2 gleichzeitig an zwei mit einander wechselwirkende Rezeptoren des Typs 1 und Typs 2 erfolgt. Bei sehr niedrigen Konzentrationen von rhBMP-2 variierten die Daten jedoch, so daß eine Kooperativität in diesem Bereich noch nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Dies wird die Aufgabe künftiger Experimente sein." @default.
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