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• W2028398321 abstract "A cloned 32P-labelled cDNA probe to potato spindle tuber viroid (PSTV) was used to investigate the possibility of applying the spot hybridization technique to the identification of 2 virois PSTV and chrysanthemum stunt viroid (CSV). The best conditions for obtaining the highest sensitivity consisted of spotting heat-denatured samples onto the nitro-cellulose membrane, then hybridizing at 42 or 55°C in the presence of 50% formamide. The technique led to detection of 100–250 pg of purified viroid RNA and to identification of the viroid in a plant extract corresponding to 0.1 mg of infected leaves. These values demonstrated a clear advantage of the hybridization technique over the electrophoretic assay. A 3H-labelled probe could be substituted for the 32P probe, but it exhibited poor sensitivity due to the initially low specific radioactivity of the 3H probe. Despite large sequence homologies, the PSTV 32P-labelled probe hybridized only with CSV in purified solutions under non-stringent conditions, e. g. low temperature (42°C) and in the presence of relatively high amounts of CSV (50 mg). Therefore, spot hybridization appeared to be a more sensitive diagnostic technique than the electrophoretic assay, but with a high degree of specificity even with apparently closely related viroids. Une sonde constituée d'un cDNA bicaténaire spécifique du viroïde du tubercule fusiforme de la pomme de terre (PSTV) et cloné a été marquée par «nick translation au moyen de 32P-dCTP et utilisée pour rechercher les conditions d'identification de deux viroïdes du même groupe, le PSTV et le virus du rabougrissement du chrysanthème (CSV) dans des solutions purifiées, des extraits bruts et des extraits partiellement purifiés obtenus à partir de plantes infectées. La technique utilisée est l'hybridation moléculaire sur membrane de nitrocellulose. Cette technique acquiert sa sensibilité maximale lorsque les échantillons sont dénaturés préalablement au dépôt sur la membrane, l'hybridation étant réalisée à 42 ou 55°C en présence de 50% de formamide. Les réactions non spécifiques sont dans l'ensemble très faibles. On peut alors détecter moins de 250 pg de PSTV purifié et identifier le viroïde dans des suspensions correspondant à moins de 0,1 mg de feuilles. Ces valeurs sont à comparer avec celles obtenues par électrophorèse (10 ng de viroïde et 10 mg de feuilles). L'utilisation d'une sonde tritiée est possible mais son usage demeurera limité: les avantages obtenus (facilité de manipulation, sécurité, longévité) ne compensent pas un certain manque de sensibilité due à une radioactivité initiale trop faible. En dépit de larges homologies (60%) de séquences entre le PSTV et le CSV, une hybridation croisée avec une sonde PSTV marquée par 32P n'est observable qu'avec des solutions purifiées de CSV, pour des quantités de viroïde supérieures à 50 ng et une température d'hybridation de 42°C. Aucune hybridation n'est observable à 55°C. Il est pratiquement impossible d'identifier avec sûreté le CSV dans des extraits de plantes infectées. Dans ces conditions, la technique d'hybridation sur nitrocellulose utilisant une sonde clonée apparaît beaucoup plus sensible que la technique électrophorétique, mais en revanche beaucoup plus spécifique." @default.
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