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• W2058381036 abstract "Introduction Deux inhibiteurs de fort enrichissement de la mutation au cours d’une PCR ou alleles mutants et sauvages subissent respectivement une amplification exponentielle et lineaire. Materiel et methodes Deux lignees cellulaires derivees de melanome humain porteuses de differentes mutations heterozygote BRAF V600 ont ete utilisees pour la mise au point de cette methodologie. Des analyses moleculaires ont ete realisees sur 18 echantillons tumoraux de melanome congeles, 17 echantillons de melanome conserves en paraffine et 17 echantillons de plasma de patients atteints de melanome avance. La technique de ice-cold PCR a ete realisee en utilisant un thermocycleur 96 puits en temps reel suivi d’un pyrosequencage, puis identification et quantification automatique de la mutation. Resultats Avec ce dosage, une large gamme de 25 pg a 25 ng d’ADN peut etre utilisee sans aucune reduction de l’efficacite de l’enrichissement de mutation. Cette technique est ultrasensible car elle peut detecter jusqu’a 0,01 % d’alleles mutes dans un fond de type sauvage. Le test a ete valide sur prelevement congeles, conserves en paraffine, et sur du plasma de patients atteints de melanome. Il a permis la detection, l’identification et la quantification de differents types de mutation du gene BRAF presents dans les echantillons qui apparaissaient sauvages en utilisant des techniques moins sensibles comme le pyrosequencage standard, la discrimination allelique ou le sequencage Sanger. Discussion Notre test a un niveau de sensibilite eleve proche de la digital PCR, il est facilement realisable facilement en une etape. Conclusion Ce test de ice-cold PCR BRAF V600 est actuellement un outil de diagnostic moleculaire extremement puissant pour la detection ultrasensible et la quantification de mutations BRAF V600 ." @default.
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