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• W2079381573 abstract "High molecular weight polysomal « messenger RNAwas isolated from various animal cells. Polysomes from various animal cells were prepared in high ionic strength buffer, in order to minimize the polysomal messenger RNA degradation. A comparative study of the sedimentation behaviour of the mRNA recovered from polysomes prepared either in isotonic TKM buffer or hypertonic TKNM buffer was performed whith mouse ascitic tumour cells labelled for 15 min with [3H] Uridine. 30 p. cent of the mRNA extracted from polysomes isolated in TKM buffer sedimented faster than 18 S. In contrast, when the polysomes were prepared in TKNM buffer 65 p. cent of the mRNA sedimented faster than 18 S. Using TKNM buffer, heavy polysomal mRNA was also isolated from [3H]pulse labelled chicken cells. 40 p. cent of the mRNA from cultivated embryonic cells and 60 p. cent of the mRNA from leukaemic myeloblasts infected with Avian Myeloblastosis Virus, sedimented ahead of 28 S. The possibility that heavy mRNA recovered from cells lysed in TKNM buffer represents nuclear RNA was examined. Unlabelled cells were homogenized in TKNM buffer with pulse labelled nuclei prepared in TKM buffer and the heavy polysomes were sedimented from the postnuclear supernatant. Very small amounts of labelled RNA sedimenting faster than 18 S were recovered. This suggests that the heavy mRNA extracted from the « TKNM polysomesdoes not originate from discrupted nuclei. The isolation of « heavy mRNAfrom the « TKNM polysomescould be explained by an efficient inhibition of the RNase action after disruption of the cells. In addition, the proportion of heavy mRNA seems increased by the elimination of the fragmented polysomes (polysomes no more engaged in protein synthesis). A « protectiveeffect due to a modification of the mRNA structure in high salt concentration is also discussed. The method we have described seems a very convenient and reproducible procedure for the isolation of undegraded polysomal mRNA from various animal cells. Des polysomes de diverses cellules animales ont été préparés en présence de fortes concentrations salines dans le but d'éviter la dégradation des RNAs messagers polysomaux. Une étude comparative des coefficients de sédimentation des RNAs messagers, extraits de polysomes préparés en tampon isotonique TKM ou en tampon hypertonique TKNM, a été effectuée à partir de cellules de tumeur ascitique de souris marquées par l'Uridine [3H] pendant 15 minutes. Environ 30 p. cent du RNA marqué extrait des polysomes isolés en tampon TKM sédimentaient au delà de 18 S. Par contre, lorsque les polysomes étaient préparés en tampon TKNM, environ 65 p. cent du RNA marqué avaient une constante de sédimentation supérieure à 18 S. Des RNAs messagers de constante de sédimentation élevée ont également été isolés des polysomes préparés en tampon TKNM à partir de cellules normales ou leucémiques de poulet, marquées pendant 15 min par l'uridine [3H]. Environ 40 p. cent du RNA messager des fibroblastes d'embryons normaux, contre 60 p. cent environ du RNA messager des myéloblastes leucémiques infectés par le virus de la Myéloblastose Aviaire, sédimentaient au delà de 28 S. Des expériences ont été effectuées pour préciser l'origine du RNA « lourdrapidement marqué isolé à partir des polysomes préparés en tampon TKNM. Des noyaux marqués, préparés en tampon TKM, ont été homogénéisés avec des cellules non marquées en tampon TKNM, et les polysomes du surnageant postnucléaire ont été sédimentés selon la technique habituelle. Une très faible quantité de RNA marqué sédimentant au delà de 18 S a pu être isolée à partir de ces polysomes, ce qui montre que le RNA lourd rapidement marqué, extrait des polysomes préparés en tampon TKNM, ne provient pas de noyaux lysés. L'isolement de RNAs messagers de constante de sédimentation élevée à partir de polysomes préparés en tampon TKNM de force ionique élevée, pourrait être expliqué par une inhibition très rapide de l'action de la RNase libérée par la lyse cellulaire. De plus, la proportion de RNA messager lourd est accrue en raison de l'élimination, par les fortes concentrations salines du tampon TKNM, des polysomes dont le RNA messager est partiellement dégradé (polysomes ne participant plus à la synthèse des protéines). Un effet « protecteurdû à une modification de la structure du RNA messager dans un tampon de forte concentration saline est également envisagé. La méthode décrite ici permet d'isoler de façon rapide et reproductible des RNAs messagers polysomaux de très haut poids moléculaire à partir de différentes cellules animales. Bei starker salinischer Konzentration wurden Polysome verschiedener tierischer Zellen mit dem Ziel, die Degradation ihrer m-RNS zu vermeiden, präpariert. Eine vergleichende Untersuchung der extrahierten m-RNS, die in einem isotonischen TKM-Tampon oder in einem hypertonischen TKNM-Tampon präpariert wurden, wurde ausgehend von Zellen eine Maus Aszitestumors, die während 15 Minuten mit Uridin(3H) markiert wurden, durchgeführt. Ungefähr 30 p. cent der markierten RNS, die aus den im TKM- Tampon isolierten Polysomen extrahiert wurden, sedimentieren über 18S. Wenn die Polysomen im TKNM- Tampon präpariert wurden, hatten 65 p. cent der markierten RNS eine Sedimentationskonstante höher als 18S. m- RNS mit hoher Sedimentationskonstante wurden gleichermaßen aus in TKNM präparierten Polysomen, die aus normalen oder leukämischen Zellen des Hühnchens stammten, die während 15 Minuten mit Uridin(3H) markiert wurden, isoliert. Ungefähr 40 p. cent m-RNS der Fibroblasten der normalen Embryos gegenüber 60 p. cent der m-RNS der leukämischen Myeloblasten, die vom Vogelmyeloblastosevirus infiziert waren, sedimentieren jenseits 28S. Um die Herkunft der « schwerenschnell markierten RNS, die ausgehend von im TKNM- Tampon präparierten Polysomen isoliert wurden, zu prüfen, wurden Untersuchungen durchgeführt. Markierte im TKM- Tampon präparierte Kerne wurden mit nicht markierten Zellen im TKNM- Tampon homogenisiert, und die Polysome der nicht sedimentierten Kerne wurden mittels der gewöhnlichen Technik sedimentiert. Eine sehr schwache Menge markierter RNS, die über 18S sedimentiert, konnte, ausgehend von ihren Polysomen, isoliert werden, was zeigt, daß die « schwereschnell markierte RNS, die aus in einem TKNM-Tampon präparierten Polysomen extrahiert wurde, nicht von den gelösten Kernen herrührt. Die Isolierung der m-RNS mit einer hohen Sedimentationskonstante, ausgehend von im TKNM- Tampon präparierten Polysomen mit hoher Ionenstärke, konnte durch eine sehr schnelle Inhibition der Tätigkeit der durch die Zellyse freigesetzeten RNase erklärt werden. Ferner ist auf Grund der Abspaltung der Polysome, deren m-RNS teilweise degradiert ist (Polysome, die nicht mehr an der Proteinsynthese teilhaben), die Menge der « schwerenm-RNS durch starke salinische Konzentration erhöht. Ein « Schutzeffektauf Grund einer Modifikation der Struktur der m-RNS in einem Tampon mit starker salinischer Konzentration wird gleicherweise in Betracht gezogen. Die hier beschriebene Methode erlaubt, ausgehend von verschiedenen tierischen Zellen, schnell und reproduzierbar m-RNS der Polysome mit hohem Molekulargewicht zu isolieren." @default.
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