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• W2155392007 abstract "Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estrategia de purificacao com duas etapas, uma cromatografia de troca ionica e uma cromatografia liquida de alta eficiencia em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rapida e pratica, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condicoes de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condicoes foi avaliada com relacao a estrutura dos N-glicanos, aos isomeros de carga e a atividade biologica em comparacao com a unica preparacao comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparacao de referencia de origem hipofisaria (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparacoes recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenarias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com niveis variaveis. As tres estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas tres preparacoes. A principal diferenca foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenarias na ausencia de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenarias na presenca de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e hibridas, a maioria delas contendo residuos terminais de acido sialico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois residuos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligacao do acido sialico a galactose nas conformacoes 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Nao foram observadas diferencas fundamentais nos isomeros de carga, nas tres preparacoes recombinantes, os perfis da focalizacao isoeletrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuicao consideravelmente diferente, com varias formas na regiao acida, foi observada, no entanto, para duas preparacoes hipofisarias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presenca de CO2 quando as preparacoes foram analisadas com boa precisao por um simples bioensaio em dose unica; esta atividade, no entanto, nao e significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparacoes sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparacao de referencia (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condicoes de cultivo nao afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuicao de isomeros de carga ou atividade biologica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta tecnica, que permite uma avaliacao exata da massa do heterodimero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferencas significativas…" @default.
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