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- W2232810562 abstract "O fator estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) e uma citocina hematopoietica que age sobre a linhagem de neutrofilos promovendo proliferacao e diferenciacao de seus precursores e ativacao dos neutrofilos maduros. O G-CSF e uma proteina com 18,8 kDa, constituida por 174 aminoacidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma cisteina livre no residuo 17. Este biofarmaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com câncer que recebem altas doses de quimioterapia. Alem disso, tambem tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de reforcar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diabeticos com infeccoes nos pes, leucemia e neutropenia febril. Em funcao desta ampla aplicacao clinica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia genetica em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome generico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das industrias farmaceuticas. Atualmente, o Brasil e totalmente dependente da importacao deste biofarmaco. Logo, o objetivo deste estudo e desenvolver uma metodologia para a posterior producao de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi construido por PCR, clonado no vetor de expressao pET23a(+), usando as enzimas de restricao NdeI e BamHI. Os testes de superexpressao foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condicao de expressao na fracao insoluvel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusao e purificar a proteina, inumeros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubilizacao dos corpos de inclusao por um processo de multiplos passos de lavagem e um metodo de purificacao usando somente uma coluna cromatografica de troca cationica. A identidade da proteina foi confirmada por sequenciamento N-terminal e Western blotting. A caracterizacao do rhG-CSF homogeneo, atraves de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padrao internacional. O teste de atividade biologica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrao internacional utilizado. A proteina foi produzida por um processo simples e economico, sendo de extrema importância em um processo industrial, podendo trazer beneficios para a saude da populacao." @default.
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