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- W2284311573 abstract "A anotacao automatica de genes atraves do sequenciamento completo do genoma de um patogeno possibilita estudar e compreender a biologia e os mecanismos de infeccao, proporcionando sistemas de controle e tratamento de pragas e doencas. Genes sao anotados por homologia e as informacoes gerais obtidas fornece indicacoes sobre a filognia do organismo, organizacao dos genes, vias metabolicas, etc. A analise cuidadosa desta anotacao e necessaria para identificar e caracterizar proteinas que nao possuem homologia com organismos ja sequenciados e ficam anotadas como proteinas hipoteticas. Dentre estas, encontram-se as proteinas responsaveis pelo auxilio da translocacao de outras proteinas, designadas chaperones de secrecao, as quais nao possuem homologia com bacterias e, portanto, nao foram identificadas no fitopatogeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Os genes, que possivelmente codificam estas chaperones, foram selecionados do genoma do patogeno com base nas caracteristicas comuns as chaperones desta familia. Este trabalho objetivou identificar, dentre as proteinas denominadas hipoteticas, quais poderiam ser chaperones de secrecao atraves da interacao proteica observada com a metodologia de duplo-hibrido. A biblioteca de duplo-hibrido foi gerada a partir de 40 possiveis genes de chaperones de secrecao selecionados. Esta biblioteca foi co-transformada com a biblioteca de fragmentos de todos os genes de Xac, possibilitando a identificacao de interacoes entre possiveis chaperones de secrecao e outras proteinas desta bacteria. Dentre estas foram selecionadas 6 proteinas para clonagem dos respectivos cDNAs em vetor de expressao da familia pET: A hipotetica chaperone flagelar XAC1990 (15046.1) e a proteina exportada FlgK; XAC1977 (6776.1), as hipoteticas XACb0033 (10073.2) e XACb0032 (11005.1) pertencentes ao sistema secretorio tipo IV, a hipotetica chaperone XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17). As proteinas XACb0032 (11005.1), XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17) permaneceram insoluveis apos expressao e tentativas de ressolubilizacao. Ja a proteina XACb0033 (10073.2), foi purificada e caracterizada sendo realizado ensaios de cristalizacao com a mesma. A possivel chaperone flagelar XAC1990 (15046.1), FlgN e a proteina exportada FlgK tambem foram purificadas e caracterizadas alem de ser confirmada in vitro a interacao obtida por duplo-hibrido em levedura (in vivo). Apenas FlgK foi submetida a ensaios de cristalizacao, uma vez que XAC1990 degrada-se em poucos dias apos purificacao. Para a caracterizacao destas duas proteinas, foram utilizadas tecnicas biofisicas como o dicroismo circular e fluorescencia do triptofano. Estas tecnicas possibilitaram a caracterizacao da estrutura secundaria das proteinas e sua estabilidade termica. Atraves dos experimentos de desenovelamento termico foi constatado que a desnaturacao termica e parcialmente irreversivel para as duas proteinas. Estes experimentos caracterizaram a estabilidade das proteinas, mas nao foram adequados para confirmar a interacao observada pelo duplo-hibrido. Todavia, a confirmacao in vitro do resultado obtido in vivo foi possivel atraves do resultado de gel filtracao analitica e do ensaio de co-preciptacao (“pull down”). A conclusao final e a identificacao de uma proteina hipotetica em Xanthomonas axonopodis pv. citri sendo que, por homologia, tambem poderao ser identificadas as proteinas de Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas campestris pv. campestris e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria como FlgN. Abstract" @default.
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