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• W2299071707 abstract "Xcc (Xanthomonas campestris pv .campestris)屬於格蘭式陰性菌，主要感染十字花科植物，造成十字花科黑腐病。 由於蛋白質的結構與功能之間有著相當的密切的關係，因此解析目標蛋白的結構更可以進一部了解該蛋白的功能以及其作用的機制。故本人的研究主要著重在挑選Xcc菌株所表達的功能性蛋白來進行大量表現以及結晶的實驗，並藉由X-ray繞射的技術以期能夠解析出蛋白三度空間結構。過去兩年中一共挑選了8個預測具有功能性的蛋白，並針對這些蛋白尋找適合的表達與結晶條件。我們的策略是先藉由嘗試帶有不同fusion protein的載體(vector)，不同的宿主(host)，以及不同的誘導(induction)條件來得到大量可溶標的蛋白，並利用純化後的蛋白來進行結晶條件的篩選。在八個標的蛋白之中，還有五個尚未找到合適的表達條件。XC2428 (deoxycytidine triphosphate deaminase) 雖然可以藉由MBP fusion protein的形式順利表達出大量可溶蛋白，然而其降解 (degradation)太快，不僅純化不易，同時也難以用於長晶。 XC20 (truncated IS1477 transposase) 雖然可以使用MBP fusion得到大量可溶蛋白，但是在使用TEV protease移除MBP之後立即會產生大量的沈澱。XC6988 (glucose inhibited division protein B) 在開始進行濃縮後即會不可逆的形成果凍狀的膠體，並且在嘗試不同的buffer條件之後仍然不見改善，不易純化。XC663 (DNA repair system specific for alkylated DNA) 雖然同樣可以藉由MBP fusion protein得到可溶的蛋白，但是卻無法以TEV protease將MBP移除。XC1741(reductase)則是在經過不同表達條件的嘗試之後都只能得到大量不可溶的inclusion bodies。XC6774預測功能是一分泌至胞外的protease，在利用 E. coli BL21(DE3)嘗試進行大量表達時發現大部分的蛋白會形成inclusion bodies，在經過嘗試之後發現，使用E. coli BL21(DE3)pLys做為宿主並於20度以IPTG induce 20小時的條件下可以得到大量的可溶蛋白，但是所得到的蛋白依然會有趨向沈澱的特性。為了得到適合進行結晶實驗的蛋白，我們更進一部的利用dynamic light scattering (DLS)進行Optimum Solubility Screen來找尋適合XC6774的buffer。最後發現到，20 mM的citric acid pH 3.0以及10%glycerol可以增加XC6774的溶解度以利XC6774的純化，但可惜在嘗試了近600種不同的條件之後並未找到合適的結晶條件。而XC3857則是被預測為一個YeeC-like蛋白，這類的蛋白在功能上的研究並不是相當清楚，同時以蛋白質序列與登錄在PDB中已知結構的蛋白進行比對的結果也並未發現相似序列的蛋白結構被發表。此標的蛋白在經過大量表達以及純化之後，嘗試了近600種結晶條件仍然未能夠發現晶體，因此同樣藉由dynamic light scattering (DLS)進行Optimum Solubility Screen從53種不同的buffer中篩選出適合的條件後，現在已經可以找到六種不同的初步結晶條件，目前正在進行手動微調，同時計畫嘗試於養晶時將其置放於高磁場中以期能夠得到品質更好的蛋白晶體。XC296預測功能為sugar aldolase，並且在pfam的資料庫裡被歸類為Aldolase_II蛋白家族的成員。相較於Aldolase_I的蛋白家族，此類蛋白在結構上的研究則較為少見。在PDB (protein data bank)中所搜尋到此類蛋白的結構目前只有一個來自E. coli的fuculose 1-phosphate aldolase (Aldolase_II)，以及另一個同樣來自於E. coli的 L-ribose-5 phosphate 4-epimerase (Alsolase-like platform) ，因此研究XC296的三度空間結構可以讓我們更加了解Aldolase_II的蛋白家族在結構上的特性。 此外，由於在此類酵素催化下進行的縮和反應具有高度的立體專一性，因此不只在學術領域，在工業的有機合成中也有相當高的研究價值。 值得一提的是，在一級序列的比對上發現XC296缺少了E. coli fuculose 1-phosphate aldolase中對於穩定反應性與立體選擇性有關的C-terminal二十餘個殘基，顯示出XC296可能利用與已知結構的aldolase II蛋白相似卻又不完全相同的機制來達到穩定反應與維持立體選擇性的目的。目前XC296已經被成功的表達並得到蛋白質晶體，同時藉由selenium multiple-wavelength anomalous dispersion (MAD)的技術已決定相位(phase)，現已經進入model building以及refinement的階段。" @default.
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