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• W2553646933 abstract "Introduction Les cultures de keratinocytes en monocouche sont couramment utilisees dans les etudes in vitro, mais celles-ci ne reproduisent pas fidelement l’architecture de l’epiderme et les caracteristiques physiologiques des differents etats de differenciation cellulaire. Dans cette etude, nous decrivons un protocole simple et rapide pour la generation d’epidermes reconstruits murins (RME) a partir de keratinocytes primaires de souriceaux. Apres avoir caracterise les differentes etapes de leur differenciation, nous analysons leur reponse a la stimulation par des cytokines proinflammatoires. Materiel et methodes Les RME sont realises a partir de keratinocytes primaires issus de peaux de souriceaux nouveau-nes cultives dans des inserts en polycarbonate dans un milieu d’ensemencement. Des l’obtention d’une monocouche cellulaire, les inserts sont passes a l’interface air-liquide au contact d’un milieu de differenciation. La caracterisation des RME est effectuee par histologie et par immunohistofluorescence pour la detection de marqueurs de differenciation incluant les keratines 14, 6, 10, la loricrine, la filaggrine, l’E-Cadherine et des connexines. Leur permeabilite est eprouvee par des tests de diffusion de la sonde fluorescente Lucifer Yellow . Enfin, la reponse des RME aux cytokines IL-17A, TNFα, IL-22, IL-1α et oncostatine M est evaluee par RT-qPCR par la mesure de l’expression de marqueurs de differenciation, de peptides antimicrobiens et de chimiokines. Resultats Notre protocole permet d’obtenir des RME qui reproduisent les caracteristiques morphologiques et phenotypiques d’un epiderme de souris en seulement 5 jours apres leur passage a l’interface air-liquide comme l’atteste l’expression des marqueurs de differenciation conforme a celle d’un epiderme natif. Les RME acquierent egalement leur fonction de barriere et sont impermeables au passage de la Lucifer Yellow . Enfin, suite a leur stimulation par des cytokines proinflammatoires, les RME repondent de maniere similaire a un epiderme in vivo par une diminution d’expression de la keratine 10, de l’involucrine et de la filaggrine et une augmentation de l’expression de mediateurs de l’inflammation tels que la chimiokine CXCL-3 et les peptides antimicrobiens S100A9 et β-defensine-3. Discussion Ce nouveau protocole permet donc de realiser rapidement et facilement des RME reproduisant fidelement l’architecture et les caracteristiques physiologiques d’un epiderme, y compris leur reponse dans un contexte inflammatoire. Conclusion Ce modele de RME permet d’etudier les mecanismes physiologiques de la peau et ouvre la perspective de realiser des RME a partir de keratinocytes issus de souris genetiquement modifiees." @default.
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