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• W2553730005 abstract "Die Existenz von Phytochromen wurde zuerst in den funfziger Jahren des vorigen Jahrhunderts in hoheren Pflanzen nachgewiesen [1]. Diese rot/dunkelrot sensitiven Photorezeptoren wurden spater dann fur Cyanobakterien berichtet [2], und im Folgenden auch in nicht-photosynthetischen Bakterien und Pilzen [3]. Phytochrome konvertieren bei Belichtung zwischen Rotlicht-absorbierenden (664/704 nm, PR Zustande) und Dunkelrot-absorbierenden Formen (707/750 nm, PFR Zustande). Diese Photokonversion beruht auf einer Doppelbindung-Photoisomerisierung des Chromophors. In dieser Dissertation wurden vier verschiedene Aspekte dieser biologischen Photorezeptoren bearbeitet: (i) Die Phytochrome CphA und CphB aus dem Cyanobakterium Calothrix PCC7601 wurden dahin gehend untersucht, zu bestimmen, welche Proteindomanen essentiell sind, um die spektrale Integritat dieser Chromoproteine aufrecht zu erhalten. Beide Proteine bilden PAS-, GAF-, PHY-, und Histidine-kinase (HK) Domanen. CphA bindet Phycocyanobilin (PCB) als Chromophor und CphB bindet Biliverdin (BV) IXα. Es zeigte sich, dass die Entfernung der HK-Domane keinen Effekt auf die Absorptionsmaxima der verbleibenden PAS-GAF-PHY Konstrukte hatte (CphA: 663/ 707 nm, CphB: 704/750 nm, fur jeweils PR/PFR; diese Werte sind praktisch identisch zu denen der Volllangenproteine). Eine weitergehende Entfernung der „PHY“-Domanen fuhrte zu einer Blauverschiebung beider Maxima fur CphA (λmax: 658/698 nm) und zu einer groseren Menge an ungefaltetem Protein; dies lies sich aus der geringeren Menge an assemblierbarem Protein ableiten. Im Fall von CphB fuhrte die gleiche Deletion jedoch zum fast vollstandigen Verlust der PFR-Absorption, wahrend die spektralen Eigenschaften der PR-Form erhalten blieben. Wahrscheinlich bildet sich stattdessen ein Intermediat mit einer deutlich geringeren Oszillatorstarke. (ii)Im zweiten projekt wurde der Versuch unternommen, nicht-naturlich vorkommende hybride Proteine zu erzeugen. Hierzu wurde die Blaulicht-sensitive LOV-Domane eines Photorezeptors aus Pseudomonas syringae (pv. tomato) mit der HK-Domane eines Rotlicht-sensitiven Phytochroms (aus CphA) fusioniert. Ziel dieses Ansatzes war die Frage, ob sich die Kinaseaktivitat auch mit einer veranderten Lichtdetektions-Domane steuern lasst. Die im Rahmen dieses Projekts erhaltenen Ergebnisse zeigen zunachst den Erhalt der typischen Blaulicht-Photochemie. (iii)Im dritten projekt wurden Untersuchungen an dem Pflanzen-pathogenen Modellorganismus P. syringae (pv. tomato DC3000) durchgefuhrt. Genomsequenz-Analysen ergaben die Existenz zweier Gene fur Rot-/Dunkelrot-sensitiven Phytochrome (PstBphP1 und PstBphP2) und eines weiteren Gens fur einen Blaulicht-sensitiven Photorezeptor (PstLOV). Die Phytochrome wurden rekombinant in E. coli exprimiert und in vitro charakterisiert. Beide Proteine zeigen die typische modulare Struktur einer Dreidomanen Chromophor-Binderegion (PAS-GAF-PHY), an die sich C-terminal eine Histidinkinase anschliest. PstbphP1 liegt in einem Operon vor, in dem ein Hamoxygenase- (HO) kodierendes Gen vorangeht, wahrend PstbphP2 von einem Gen gefolgt wird, das fur einen response regulator kodiert. Heterologe Expression des HO-Gens ergab ein grunes Protein (λmax = 650 nm), dessen Farbe charakteristisch fur gebundenes Biliverdin ist. Die heterologe Expression von PstbphP1 und PstbphP2 ergaben in beiden Fallen die Apoproteine, allerdings lies sich nur im Fall von PstbphP1 das Holoprotein durch Zugabe von Biliverdin erzeugen. Beide Phytochrome wurden auch mit der Hamoxygenase ko-exprimiert, aber auch in diesem Falle konnte nur fur PstbphP1 das Holoprotein nachgewiesen werden, wahrend fur sein Paralog PstbphP2 keine Chromophorabsorption nachgewiesen werden konnte. Eine noch mehr erhohte Ausbeute an Protein mit verbesserten spektralen Eigenschaften wurde erhalten, wenn die vorhandene Operonstruktur ausgenutzt wurde, allerdings versagte dieser Ansatz wiederum fur PstbphP2 (hier wurde Basen-genau das kodierende Gen fur PstbphP2 an die Stelle von PstbphP1 gesetzt). Als Ursache fur die deutlich verbesserte Ausbeute von PstbphP1 konnte eine Komplexbildung dieses Proteins mit der HO wahrend der Expression nachgewiesen werden, die offensichtlich stabilisierend auf das Phytochrom wirkt. (iv)Die regulatorische Funktion der Rot-/Dunkelrot-sensitiven Phytochrome und auch des Blaulicht-sensitiven Rezeptors fur das Bakterium wurden im vierten Teilprojekt durch knock-out insertierte Mutanten nachgewiesen. Da die ublicherweise angewandte Methode des Gentransfers mittels Konjugation/homologer Rekombination sehr zeitaufwandig und von geringer Effizienz ist, wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt, um nun mit Hilfe linearer doppelstrangiger DNA Interposon- und Punktmutationen dieser Photorezeptoren zu erzeugen. Vier Einzelmutanten, bphP1Δ, bphP2Δ, bphOΔ, pspto_2896 (LOVΔ) und eine Doppelmutante, bphP1ΔbphP2Δ, wurden auf diese Weise erzeugt. Die bphO- und pspto_2896 (LOV) Gene kodieren die bereits in (iii) diskutierten Hamoxygenase und den Blaulicht-sensitiven Photorezeptor. Der pspto_2896 Mutant-Stamm wurde auf seine Motilitat in blauem Licht getestet (447 nm), wahrend alle anderen Mutanten in rotem bzw. dunkelrotem Licht (625, 660, 720, 740 nm) auf Anderungen ihrer Motilitat untersucht wurden. Es wurden fur alle Mutanten Anderungen in ihrer Photokinese gefunden. Daruber hinaus wurde untersucht, ob die Mutantenstamme (bphP1Δ und der Blaulicht-Photorezeptor defiziente Stamm, LOVΔ) eine veranderte Infektivitat gegenuber Pflanzen aufwiesen (Arabidopsis thaliana). Erste Ergebnisse zeigen, dass der Blaulicht- Photorezeptor im Wildtyp-Stamm im Vergleich zur Mutante unter Belichtung zu verringertem Wachstum fuhrt, wahrend kein entsprechender Effekt fur den Phytochrom-Rezeptor nachweisbar war." @default.
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