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• W2775596523 abstract "Das Ziel dieser Arbeit war die Validierung der OSCARR Methode (One-pot, simple cassette randomization and recombination) fur fokussierte gerichtete Evolution, die von Dr. Hidalgo entwickelt wurde. Sie basiert auf der Megaprimer PCR, die auseren Primer besitzen unterschiedliche Schmelztemperaturen und asymmetrische Zyklen vor der Zugabe des Vorwartsprimers dienen der Unterdruckung von Wildtyp-Amplifikation. Als mutagene primer dienen sogenannte spiked oligonukleotide, die mit Hilfe eines Algorithmus entworfen werden und strikt definierte Nukleotidzusammensetzungen an jeder Position aufweisen. Eine OSCARR Bibliothek der Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) mit ca. 8000 Klonen wurde angelegt und auf veranderte Kettenlangenspezifitat uberpruft. Zwei Mutanten mit erhohter Aktivitat gegenuber mittelkettigen p-Nitrophenylestern wurden identifiziert, die beide die Mutation F126I tragen. Durch diese Mutation wird der Substrattunnel erweitert, wodurch groseren Substraten der Zugang zum aktiven Zentrum erleichtert wird. Eine Mutante trug die zusatzliche Mutation G120S, die eine katalytische Tetrade vervollstandigt, wie sie in Serinproteasen vorliegt. F126 beeinflusst die Kettenlangenspezifitat allerdings starker, so dass weitere Aminosauren des Substrattunnels („bottleneck“) mutiert wurden, um die Offnung weiter zu vergrosern. Es wurden Einfach-, Doppel-, Dreifach- und Vierfachmutanten generiert, die vor allem Kombinationen aus F126L, F144L, F159L und I225L sind. Diese Mutanten wurden dann auf veranderte Enantioselektivitat gegenuber chiralen Sauren und Alkoholen uberpruft. Fur die Substrate 1-Phenyl-1-propylacetat (2), 1-Phenyl-2-propylacetat (3) und 1-Phenyl-1-ethylacetat (4) wurden Mutanten mit erhohter Enantioselektivitat gefunden. I225L spielt eine wichtige Rolle, da es unabdingbar fur die Enantioselektivitat gegenuber 3 ist, wahrend es die selektivitat gegenuber 2 zerstort, was durch Vergleich der Dreifachmutante ohne I225L mit der Vierfachmutante offensichtlich wird. Die Einfachmutante I225L ist allerdings weniger selektiv gegenuber 3 als der Wildtyp, synergistische Effekte zwischen Mutationen sind also von groser Wichtigkeit. Der PFE I Wildtyp besitzt bereits eine gute Enantioselektivitat gegenuber 4, aber alle analysierten Mutanten ubertreffen den Wildtyp deutlich. Mit Hilfe des Programms YASARA wurden Dockings fur beide Enantiomere von 2 und 3 in den PFE I Wildtyp und die jeweils beste Mutante durchgefuhrt. Durch die Erweiterung konnen die Substrate im Wildtyp ihren Phenylring immer in Richtung des Tunnels orientieren, dies ist im Wildtyp nur fur (R)-2 moglich. Die Reste 126 und 144 sind relativ weit vom Substrat entfernt und beeinflussen vermutlich die Diffusion. Weiterhin sollte promiskuitive Amidase-Aktivitat in der PFE I hervorgerufen werden. Auf der Suche nach strukturell homologen Enzymen mit Amidase-Aktivitat fand sich die --Lactamase aus Aureobacterium sp., die nach ihrer Aktivitat gegenuber dem Vince Lactam 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on benannt wurde. Biokatalysen mit der PFE I und einigen Mutanten zeigen exzellente Selektivitat gegenuber dem (-)-lactam. Die spezifischen Aktivitaten einiger aufgereinigter Enzyme wurden bestimmt, die Aktivitat einiger Mutanten lag in der selben Grosenordnung wie die Aktivitat der Lactamase." @default.
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