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• W2793200123 abstract "Objetivos de la Tesis La interaccion sexual es el principal regulador de la produccion de carotenos en la mayoria de los Mucorales y es esencial en los procesos industriales desarrollados para producirlos con Blakeslea y Phycomyces. Los compuestos quimicos que median la sexualidad de los Mucorales y activan la carotenogenesis son derivados del caroteno s. Esta Tesis pretende ampliar el conocimiento del proceso sexual de P. blakesleeanus, y especialmente de la ruta metabolica de los apocarotenoides. Capitulo 1 Apocarotenoides de Phycomyces Enfoque de las investigaciones El estudio de los apocarotenoides conlleva la extraccion, la separacion y la identificacion simultanea de muchos compuestos de cultivos separados, resultantes de la siembra de esporas de una sola estirpe, y de cultivos mixtos, resultantes de la siembra de una mezcla de esporas de ambos sexos. Para ello utilizamos las estirpes silvestres NRRL1555, de sexo (-), y NRRL1554 y A56, de sexo (+), y los mutantes blancos C5, de sexo (-), y S342, de sexo (+). Estos mutantes del gen carB acumulan grandes cantidades de fitoeno, pero son incapaces de producir caroteno s. Por lo tanto no pueden tener derivados del caroteno s tales como los trisporoides. Se toman como derivados del caroteno s (apocarotenoides) y entre ellos los trisporoides, los compuestos encontrados en cultivos de estirpes silvestres que no se encuentren en los de los mutantes carB. Se usaron tres clases de medios solidos: agar minimo, agar nutritivo y agar papa; los dos primeros se combinaron ademas con acetato. Estos medios se inocularon con esporas de una estirpe o de dos estirpes de sexo opuesto y se incubaron cinco dias. Los materiales de partida para los analisis son extractos de los medios de cultivo obtenidos por congelacion, descongelacion y presion de las masas de agar.Capitulo 2 El gen triD Introduccion Este capitulo contiene el aislamiento y caracterizacion del gen triD de la estirpe patron de Phycomyces blakesleeanus, responsable de la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, que cataliza el paso del dihidrotrisporato de metilo a trisporato de metilo. El gen triD fue el primero de la ruta biosintetica de los acidos trisporicos que se aislo y se secuencio. El Prof. J. Wostemeyer y sus colaboradores, de la Universidad Friedrich Schiller, de Jena (Alemania), purificaron esa deshidrogenasa de extractos crudos de micelios de Mucor mucedo de la estirpe de sexo (-) cultivados en presencia de acidos trisporicos. Para ello fraccionaron los extractos y ensayaron la actividad enzimatica, midiendo el NADPH producido por reduccion del cofactor NADP durante la oxidacion del sustrato dihidrotrisporato de metilo. Este sustrato habia sido obtenido por metilacion y reduccion quimica de un extracto enriquecido en acidos trisporicos de un cultivo mixto de Blakeslea trispora. Con las secuencias peptidicas disenaron dos mezclas de oligonucleotidos que usaron como cebadores para obtener por PCR un fragmento de ADN genomico de 0,7 kb y con este escrutaron una genoteca parcial. Obtuvieron asi el gen de Mucor mucedo responsable de la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, que llamaron tdh (Czempinski et al., 1996). Los mismos cebadores permitieron obtener fragmentos del mismo gen de otros Cigomicetos (Parasitella parasitica, Absidia glauca y Blakeslea trispora). En los albores de este trabajo establecimos una colaboracion con la Universidad de Jena. En las semanas anteriores a mi llegada a Jena, el grupo aleman aislo un fragmento de 983 pb de ADN del gen homologo de Phycomyces. Para aislar este fragmento, utilizaron dos cebadores disenados a la vista de las secuencias conservadas de Mucor y Parasitella.Capitulo 3 Expresion del gen triD Introduccion Como ya disponiamos de las regiones flanqueantes, no traducidas, del gen triD, una secuencia anterior de 156 pb y otra posterior de 522 pb, nos propusimos investigar el inicio y el final de su transcripcion. Analizamos tambien el efecto de la estimulacion sexual sobre la transcripcion, para ello comparamos cultivos mixtos con cultivos separados. La expresion del gen en la bacteria Escherichia coli permitio la purificacion de la proteina correspondiente.Capitulo 4 Evolucion del gen triD Introduccion Caracterizado el gen triD de Phycomyces blakesleeanus, buscamos secuencias similares en mutantes con distintas respuestas sexuales y en estirpes naturales de Phycomyces aisladas por nosotros o presentes en colecciones internacionales. Para establecer una relacion evolutiva entre las estirpes, comparamos estas secuencias genicas con las homologas de Mucor mucedo y Parasitella parasitica, ya conocidas, y con las mas parecidas a la del gen triD que se encuentran en los genomas completos de Rhizopus oryzae y Mucor circinelloides. Tambien comparamos el gen triD y los demas presuntos genes que codifican para aldocetorreductasas de P. blakesleeanus, R. oryzae y M. circinelloides.Conclusiones 1. Los apocarotenoides se identifican facilmente por un metodo genetico: estan ausentes de los cultivos separados o mixtos de mutantes carB incapaces de producir caroteno. 2. Se han establecido condiciones y metodos apropiados para separar los apocarotenoides. Se han identificado veinticinco apocarotenoides; el Prof. A. Fernandez Barrero y sus colaboradores de la Universidad de Granada han establecido las estructuras moleculares de algunos. Tres de ellos son nuevos para la ciencia: el trispoxano y los acidos (2E,4E)-6-hidroxi-5-metilhexa-2,4-dienoico y (2E,4E)-6-hidroxi-2-metilhexa-2,4-dienoico. 3. La deteccion de los acidos hidroximetilhexadienoicos implica que el caroteno s se rompe en tres fragmentos, que son las cabezas de tres series de compuestos, los trisporoides, formada por compuestos de 18 carbonos; los monociclofarnesanos, de 15 carbonos y los dos acidos hidroximetilhexadienoicos, de 7 carbonos. Los compuestos de 15 carbonos no derivan de los trisporoides. 4. Los cultivos separados de tres estirpes silvestres contienen poca cantidad y escasa diversidad de apocarotenoides. Las diferencias que se observan entre ellas se deben a su sexo y a diferencias en el fondo genetico. 5. El acetato y la papa, que inhiben la carotenogenesis sexual y estimulan la formacion de cigosporas, presentan mecanismos de accion diferentes. El primero anula la produccion de ocho apocarotenoides y el segundo de cuatro. Ademas, ambos inhiben considerablemente la produccion de un acido trisporico muy abundante. Entre estos compuestos deben hallarse los responsables de las acciones fisiologicas. 6. Se ha aislado y caracterizado el gen para la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, al que llamamos triD, que cataliza el paso de dihidrotrisporato de metilo a trisporato de metilo. 7. La interaccion sexual no estimula la transcripcion del gen triD. 8. La reciente secuenciacion completa de los genomas de P. blakesleeanus, R. oryzae y M. circinelloides ha permitido identificar el gen triD y las secuencias genicas mas parecidas al mismo y establecer cladogramas para estas secuencias y las de genes homologos ya conocidos en otros Cigomicetos. 9. La caracterizacion molecular de las estirpes silvestres de Phycomyces confirma la existencia de dos especies dentro de este genero: P. blakesleeanus y P. nitens. Estas especies son muy distantes entre si y muy uniformes internamente. 10. Phycomyces se encuentra mas proximo a M. circinelloides que a R. oryzae. La topologia de estas relaciones apoya la conservacion de la familia Mucoraceas y se opone a la creacion de la familia Ficomicetaceas para el genero Phycomyces." @default.
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