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• W2912431037 abstract "Las enfermedades de transmision alimentaria son aquellas de naturaleza infecciosa o toxigenica que han sido causadas por el agua o los alimentos. Se estima que alrededor del 30% de la poblacion mundial las padece cada ano y aunque no suelen ser mortales, pueden ser bastante incapacitantes. Asi mismo se generan elevados costes economicos producto de bajas laborales, mercancia inmovilizada y analisis de lotes de alimentos. La higiene y la seguridad microbiologica de los alimentos estan convenientemente reguladas por varias normas y reglamentos, los cuales establecen los limites de tolerancia para los patogenos causantes de estas enfermedades, como son: B. cereus, C. jejuni, C. perfringens, C. sakazakii E. coli, la familia Enterobactericeae, L. monocytogenes, Salmonella spp, Shigella spp y S. aureus. Habitualmente en la industria alimentaria y los laboratorios de analisis se recurre a la deteccion y cuantificacion de estos microorganismos mediante tecnicas basadas en la microbiologia clasicas, las cuales requieren una inversion de tiempo elevada y generan resultados en tiempos que van desde 24 horas hasta varios dias. Los metodos basados en genetica molecular se presentan como una alternativa rapida, sencilla y eficaz para llevar a cabo la misma tarea. En este trabajo se han disenado dos metodos, uno para la deteccion simultanea de ocho especies, dos generos y una familia de microorganismos patogenos de origen alimentario, mediante PCR multiplex; y otro para la cuantificacion de cuatro especies y una familia de microorganismos patogenos de transmision alimentaria mediante qRTi-PCR. Para el primero han sido seleccionadas dianas geneticas conservadas y especificas para cada microorganismo, sobre las cuales se han disenado parejas de cebadores que han sido evaluados tanto en modo uniplex, como en modo multiplex, obteniendose amplificacion simultanea y reproducible de las siete especies, dos generos y una familia de patogenos. Para el segundo metodo se han escogido dianas para cada microorganismo, a partir de las cuales se han disenado parejas de cebadores y sondas TaqMan, que han sido ensayadas en modo uniplex y duplex, obteniendose amplificacion positiva en cada caso para cada microorganismo. Para evitar la aparicion de falsos resultados negativos se ha disenado un control interno de amplificacion quimerico (QIAC), el cual consiste en una secuencia de ADN heterologa flanqueda por las secuencias de hibridacion de las parejas de cebadores. Para este control interno se diseno una sonda especifica con tres versiones, marcadas con fluoroforos diferentes de tal forma de que la misma pueda ser usada en todas las combinaciones posibles. Se llevaron a cabo reacciones de qRTi-PCR incluyendo el QIAC en las que se obtuvo amplificacion y senal de todas las sondas presentes. Adicionalmente, para eliminar la amplificacion de ADNg proveniente de celulas no viables, se optimizo un metodo basado en un agente intercalante del ADN, el EMA; el cual inhibe la amplificacion del ADN de celulas con estas caracteristicas. La aplicacion del mismo ha permitido observar un aumento del Ct respecto aquellas muestras en las cuales no se ha aplicado. Ambos metodos han sido validados respecto al metodo clasico con cinco tipos de matrices alimentarias: carnicos, pescado, preparados, pasteleria y lacteos. La misma ha mostrado porcentajes de coincidencia entre metodos de hasta el 92%, cuando se comparan le metodo clasico y el de mPCR. Para el caso de la qRTi-PCR, se han obtenido diferencias entre las medias de ambos metodos y una baja correlacion entre ellos, mientras que se ha demostrado la capacidad de generar datos homogeneos del metodo de qRTi-PCR, lo que se evidencia en valores altos del coeficiente de correlacion e igualdad de medias." @default.
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