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• W3010675209 abstract "Trypanosoma brucei es un parasito protozoario de la clase Kinetoplastida, agente causal de la tripanosomiasis humana africana (HAT) o comunmente conocida como la “enfermedad del sueno”. La transmision esta mediada por la picadura de la mosca tsetse (del genero Glossina) y tanto parasito como vector se localizan mayoritariamente en el Africa subsahariana. Tras el desarrollo de numerosas iniciativas enfocadas al control de la enfermedad, el numero de nuevos casos ha disminuido considerablemente, registrandose tan solo 977 casos en 2018 (WHO 2019). Sin embargo, a pesar de estos datos prometedores, los tratamientos disponibles siguen siendo escasos y muy toxicos, y el desarrollo de resistencias constituye un inconveniente adicional (Buscher et al. 2017). Por esta razon, el descubrimiento de nuevos blancos de accion sigue siendo prioritario para mejorar la terapia contra la enfermedad. Por otra parte, T. brucei constituye un organismo modelo para el estudio de la biologia de kinetoplastidos. La disponibilidad de sofisticadas herramientas de manipulacion genetica unido a la facilidad de cultivo y mantenimiento hacen de este organismo un paradigma para el estudio de la biologia de organismos eucarioticos unicelulares. En todos los organismos la preservacion de la integridad genomica es esencial, y en concreto, el correcto mantenimiento de los niveles de los nucleotidos (dNTPs) posee un papel primordial. De hecho, desequilibrios en el “pool” de dNTPs da lugar a procesos que comprometen gravemente la viabilidad celular, como genotoxicidad, mutagenesis o tumorogenesis (Kohnken et al. 2015). De esta manera, los componentes del metabolismo de nucleotidos pueden suponer una fuente importante de dianas terapeuticas. Los dNTPs pueden ser sintetizados en la mayoria de organismos por dos rutas metabolicas, la via de recuperacion de nucleosidos pre-formados y la sintesis de novo (Wang 2016). Mientras que T. brucei carece de las enzimas necesarias para sintetizar purinas de novo, es capaz de sintetizar los nucleotidos de pirimidina por ambas vias. A pesar de esta aparente redundancia metabolica para la generacion de precursores pirimidinicos, ciertas enzimas implicadas en la biosintesis del timidilato, como la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS), timidina kinasa (TK), desoxiuridina trifosfato hidrolasa (dUTPasa) o la citidina desaminasa (CDA), han demostrado ser esenciales para la viabilidad del parasito (Sienkiewicz et al. 2008; Castillo-Acosta et al. 2013; Leija et al. 2016; Valente et al. 2016). En concreto, lineas de T. brucei deficientes en TK no son viables y acumulan nucleosidos intracelulares tanto en ausencia como en presencia de un aporte exogeno de nucleosidos. Por otra parte, se ha demostrado que la fosforilacion de la desoxiuridina (procedente de la desaminacion de la desoxicitidina) via TK es un paso esencial en la sintesis de timidilato. Estas observaciones plantean la hipotesis de que T. brucei expresa nucleotidasas implicadas en la formacion de nucleosidos intracelulares esenciales para la sintesis de timidilato. Por esta razon, el objetivo principal de esta tesis fue la identificacion de dNTPasas en T. brucei que pudieran estar implicadas en este proceso. En un esfuerzo por caracterizar nucleotidasas en el genoma de T. brucei, se han identificado dos nucleotidohidrolasas que contienen un dominio “histidine-aspartic acid” (HD) y que estan relacionadas con la proteina humana “sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1” (SAMHD1), que es una trifosfato desoxinucleosido (dNTP) hidrolasa que juega un papel esencial en la homeostasis de dNTPs/nucleosidos a lo largo del ciclo celular. Los dos paralogos identificados en Trypanosoma exhiben un dominio HD altamente conservado pero carecen del dominio SAM, y se denominaron TbHD52 y TbHD82. En este trabajo, se ha evaluado el papel de estos ortologos en viabilidad celular y control de la homeostasis de nucleotidos. Ambas proteinas mostraron una localizacion diferencial, asi como un diferente impacto sobre la proliferacion celular. Mientras que TbHD82 era nuclear y prescindible, TbHD52 demostro ser una proteina mitocondrial esencial para la viabilidad, y celulas “knock-out” para la enzima son auxotrofas para timidina. La expansion del “pool” de dTMP en lineas deficientes en TbHD52, ya sea por suplementacion del medio con nucleosidos de pirimidina o por la complementacion con la enzima dCMP desaminasa humana, revierte el fenotipo deletereo. Las observaciones obtenidas indican que TbHD52 tiene un papel central en la provision de desoxinucleosidos pirimidinicos necesarios para la division celular. Asimismo, la ausencia de TbHD52 induce graves defectos en la progresion del ciclo celular, caracterizado por una parada en las fases S y G2/M y por la aparicion de poblaciones aberrantes en cuanto al numero y apariencia de nucleos y kinetoplastos. La cuantificacion de dNTPs junto con un analisis metabolomico global de las lineas TbHD52-nulas puso de manifiesto profundas modificaciones en el perfil de precursores pirimidinicos, caracterizadas por una acusada acumulacion de dCTP y derivados de citidina, asi como una deplecion significativa de dTTP y derivados de timidina. Estos resultados, junto con la intensa activacion de foci nucleares de ɣH2A, un marcador temprano de dano en el DNA, sugieren que TbHD52 tiene un papel central en la homeostasis de dNTPs y en el abastecimiento de la desoxicitidina y timidina destinadas a la biosintesis de timidilato. Adicionalmente, a pesar de la estricta regulacion de los niveles de dNTPs, en el DNA se producen constantemente lesiones derivadas del metabolismo endogeno o de agentes externos, los cuales pueden causar importantes danos como mutaciones o fragmentacion (Chatterjee and Walker 2017). De hecho, durante el proceso de infeccion en el torrente sanguineo, los parasitos estan especialmente expuestos a estres oxidativo por la accion del sistema inmune. Para contrarrestar esta situacion y preservar la integridad genomica, las celulas activan multiples mecanismos de reparacion, entre los cuales destaca la ruta de reparacion de DNA por escision de bases (BER). La enzima uracil-DNA glicosilasa (UNG), inicia la ruta de BER ante la presencia de uracilo en el DNA (Jacobs and Schar 2012). En este contexto, durante la respuesta inmune primaria, el oxido nitrico (NO) es liberado por los fagocitos, y en combinacion con los radicales de oxigeno producen especies reactivas de nitrogeno que reaccionan con el DNA, generando roturas de cadena y bases modificadas (incluyendo desaminaciones de citosina), los cuales son sustratos para la UNG (Fang 1997). Estudios previos han demostrado la importancia de UNG para la virulencia de T. brucei (Castillo-Acosta et al. 2012), por lo que en esta tesis se ha profundizado en el dano en el DNA que se genera en respuesta al estres oxidativo durante la interaccion entre el patogeno y el huesped in vivo. Se ha analizado el contenido en uracilo y sitios abasicos en el DNA, asi como la cantidad de foci de ɣH2A tanto in vitro, tras el tratamiento con donadores de NO, como in vivo, en parasitos aislados tras infeccion en modelos murinos. Los resultados ponen de manifiesto la aparicion de dano genotoxico en T. brucei tras la exposicion al NO in vitro y muestra que la ausencia de UNG genera mayores niveles de dano en el DNA. Por otra parte, los parasitos recuperados de ratones exhiben niveles mas altos de roturas de cadenas de DNA, desaminacion de bases y focos de reparacion en comparacion con las celulas cultivadas in vitro, y la ausencia de UNG conduce a un mayor dano del DNA tambien en infecciones animales. Estas observaciones sugieren que la respuesta inmune desarrollada por el huesped genera estres oxidativo y dano en el DNA del parasito y enfatiza la importancia de BER en la proteccion contra el estres genotoxico y oxidativo en T. brucei." @default.
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