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- W3081984806 abstract "Industrielle Verfahren stellen haufig hohe Anspruche an die Stabilitat von Biokatalysatoren. In vielen Fallen ist daher eine Stabilisierung von Enzymen notwendig, um den verschiedenen, oft extremen Prozessbedingungen gerecht zu werden und einen biokatalytischen Prozess effizient zu gestalten. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine neue Strategie zur Stabilisierung von Enzymen durch Erhohung der Oligomerisierung etabliert werden, da es Beispiele fur oligomere Enzyme gibt, welche stabiler sind als homologe monomere Varianten. Zu diesem Zweck wurde das dimere Modellenzym Arabidopsis thaliana Hydroxynitril Lyase (AtHNL) mit einem tetrameren coiled coil, der Tetramerisierungs-Domane des Zelloberflachenproteins Tetrabrachion (TDoT) aus Staphylothermus marinus, fusioniert. Das Fusionsprotein wurde in Escherichia coli produziert, bildete allerdings unter verschiedensten Kultivierungsbedingungen lediglich grose Mengen an inclusion bodies (IB), wahrend kein losliches Protein nachgewiesen werden konnte. Dennoch konnte uberraschenderweise in der unloslichen Fraktion aufgeschlossener Zellen Aktivitat gemessen werden. Diese durch Fusion mit dem TDoT-tag erhaltenen katalytisch aktiven IBs (KatIBs) wurden eingehender charakterisiert. Dabei konnte im Vergleich zur wildtypischen AtHNL festgestellt werden, dass der pH-Wert einen geringeren Einfluss auf die Aktivitat der AtHNL-KatIBs hatte und diese im schwach sauren pH-Bereich deutlich stabiler waren. Des Weiteren konnten AtHNL-KatIBs aufgrund ihrer Unloslichkeit in wassrigen Puffersystemen und organischen Losungsmitteln als naturliche Immobilisate zur Synthese von enantiomerenreinen (R)-Cyanhydrinen eingesetzt und in mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionen wiederverwendet werden. Daruber hinaus konnte das Konzept der Bildung von KatIBs durch Fusion mit dem TDoT-tag auf weitere Zielproteine ubertragen werden. So konnte die Bildung fluoreszenter YFP-IBs (yellow fluorescent protein) mittels Mikroskopie in vivo verfolgt werden. Anhand der komplexeren 2 Succinyl-5-Enolpyruvyl-6-Hydroxy-3-Cyclohexen-1-Carboxylat-Synthase aus E. coli (EcMenD) konnte zusatzlich gezeigt werden, dass die Bindung von Kofaktoren (ThDP, Mg2+) und eine korrekte Auspragung von Quartarstrukturen keine Limitierung der KatIBs darstellen. Auserdem konnten EcMenD-KatIBs erfolgreich fur die Synthese verschiedener 5 Hydroxy-4-oxo-5-Arylpentanoate eingesetzt und mittels einfachster Methoden in acht aufeinanderfolgenden Reaktionen ohne Aktivitatsverlust wiederverwendet werden. Ohne Optimierung der Expressionsbedingungen konnten KatIBs im Gramm-Masstab aus einer 500 ml Expressionskultur gewonnen werden. Die entsprechenden Praparationen ahneln bezogen auf ihre Reinheit (> 85 %) einer mittels chromatographischen Methoden gereinigten Enzym-praparation. Aufgrund dieser Eigenschaften sind KatIBs somit eine hervorragende Alternative zu konventionellen Enzymimmobilisaten, was in Zukunft eine breite Anwendung in der Biokatalyse ermoglichen konnte." @default.
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