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• W3138796217 abstract "Die Enzymsuperfamilie der loslichen Sulfotransferasen (SULT) spielt eine wichtige Rolle in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus. Sie katalysieren den Transfer einer Sulfonylgruppe auf nucleophile Gruppen endogener und exogener Substrate. Die Sulfokonjugation von Fremdstoffen erhoht deren Wasserloslichkeit und behindert die passive Permeation von Zellmembranen. Dadurch wird die Ausscheidung dieser konjugierten Substanzen erleichtert. In Abhangigkeit von der Struktur des Zielmolekuls kann die Sulfokonjugation aber auch zur metabolischen Aktivierung von Fremdstoffen durch die Bildung instabiler Metabolite fuhren. Die SULT-vermittelte Aktivierung promutagener Substanzen ist somit von toxikologischem Interesse. Fur die Detektion SULT-vermittelter Mutagenitat mittels bakterieller in-vitro Testsysteme ist die heterologe Expression der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme direkt in den Indikatorzellen notwendig. S. typhimurium exprimieren selbst keine SULT, und externe Metabolisierungssysteme sind problematisch, weil die negativ geladenen, kurzlebigen Metabolite nur schlecht die Zellmembran penetrieren konnen. Die Expression humaner Enyme in Bakterien ist jedoch zum Teil sehr kritisch. So zeigen z.B. sehr ahnliche Enzyme (SULT1A2*1 und *2) deutliche Unterschiede im Expressionsniveau bei exakt gleichen auseren Bedingungen. Dies erschwert den Vergleich der enzymatischen Aktivitaten dieser Enzyme im in-vitro Testsystem. Andere Enzyme (z.B. SULT2B1b) werden unter Verwendung ihrer Wildtyp-cDNA zum Teil nicht detektierbar exprimiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine Methode zur Optimierung der heterologen Expression fremdstoffmetabolisierender Enzyme fur Genotoxizitatsuntersuchungen etabliert werden. Es wurde bereits gezeigt dass synonyme Codonaustausche am 5’-Ende der humanen SULT1A2-cDNA zu einer Erhohung der Expression des entsprechenden Enzyms in S. typhimurium fuhrten. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Codonaustausche am 5’-Ende der cDNA verschiedener SULT (1A1*1, 1A2*1, 2B1b) sowie der Ratten Glutathion-S-Transferase Theta 2 (rGSTT2) und dem Reportergen Luciferase durchgefuhrt. Die Expression der so generierten Konstrukte wurde in verschiedenen S. typhimurium und E. coli Stammen quantifiziert und die Aktivitat der uberexprimierten Enzyme im Ames-Test bzw. im Enzym-Aktivitatsassay uberpruft. Durch das Einfuhren seltener Codons in die cDNA konnte die Proteinexpression von SULT1A1*1, SULT1A2*1 und SULT2B1b maximal 7-fach, 18-fach und 100-fach im Vergleich zur Wildtyp-cDNA gesteigert werden. Die Expression der rGSTT2 wurde ebenfalls durch das Einfuhren seltener Codons erhoht (maximal 5-fach). Bei dem Reportergen Luciferase jedoch fuhrte das Austauschen haufiger Codons gegen seltene Codons zu einer Reduktion der Proteinexpression um 80 %. Die Expression von Fusionsproteinen aus 2B1b (5’-Ende) und Luciferase (3’-Ende) wurde durch das Einfuhren seltener Codons ebenfalls um 50 % reduziert. Die S. typhimurium Stamme mit optimierter SULT 1A1*1- bzw. 1A2*1-Expression wurden im Ames-Test eingesetzt und zeigten im Vergleich zu den geringer exprimierenden Stammen eine hohere Sensitivitat. Fur SULT2B1b konnte keine Mutagenaktivierung im Ames-Test nachgewiesen werden. Allerdings zeigte ein Enzym-Aktivitatsassay mit Dehydroepiandosteron, dass das bakteriell exprimierte Enzym funktionell war. Da in der Literatur der Effekt seltener Codons auf die Expression in Bakterien bisher fast ausschlieslich als inhibitorisch beschrieben wurde, sollte die Wirkungsweise der hier beobachteten Expressionserhohung durch seltene Codons genauer untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Konstrukte der SULT1A2*1 und der SULT2B1b, die unterschiedlich viele seltene Codons in verschiedenen Kombinationen besasen, hergestellt. Es konnten jedoch keine einzelnen Codons, die fur die Expressionssteigerung allein verantwortlich waren, identifiziert werden. Die Plasmidkopienzahl in den verschiedenen SULT2B1b-Klonen war konstant und die SULT2B1b-mRNA-Konzentration zeigte nur moderate Schwankungen, die nicht als Ursache fur die dramatische Erhohung der SULT2B1b-Expression in Frage kommen. Die berechnete Stabilitat der potentiellen mRNA-Sekundarstrukturen wurde durch die seltenen Codons haufig stark gesenkt und ist als eine mogliche Ursache fur die Expressionssteigerung anzusehen. Zusatzlich erhohten die seltenen Codons den Consensus der Downstream Box zur 16S rRNA, was ebenfalls eine Ursache fur die Expressionssteigerung sein kann. In dieser Arbeit konnte somit die Expression der humanen SULT1A1*1, 1A2*1 und der 2B1b sowie der rGSTT2 erfolgreich mittels synonymer Codonaustausche erhoht werden. Die so optimierten S. typhimurium Stamme zeigten im Ames-Test eine erhohte Sensitivitat gegenuber SULT aktivierten Promutagenen bzw. erhohte Aktivitat in spezifischen Enymaktivitatsassays." @default.
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