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- W3146998655 abstract "Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklarung des allosterischen Mechanismus zweier bakterieller Transkriptionsregulatoren, und zwar von YvoA aus Bacillus subtilis und dem reversen Tetracyclin-Repressor L17G aus Escherichia coli (revTetR1). YvoA ist ein Transkriptionsregulator aus der GntR/HutC Familie, der mutmaslich die Genexpression N-Acetylglucosamin-abbauender Enzyme in B. subtilis kontrolliert. Die Kristallstruktur von freiem YvoA in voller Lange wurde mittels multi-Wellenlangen anomaler Dispersion bei 2.40 A Auflosung gelost. Die Struktur zeigt einen dimeren Aufbau aus zwei Domanen, namlich einer DNA- und einer Effektor-Bindestelle in der N-terminalen bzw. der C-terminalen Domane. Die C-terminale Domane weist eine Chorismat-Lyase-Faltung mit einem antiparallelen β-Faltblatt im Kern auf, das das Dimer-Interface bildet. Zielgerichtete Mutagenese in Verbindung mit kalorimetrischen Messungen zeigten eine N Acetylglucosamin-6-Phosphat-Bindestelle auf dem zentralen antiparallelen β-Faltblatt auf. Die N-terminale Domane enthalt ein winged Helix-Turn-Helix DNA-Bindemotiv in einer vermutlich induzierten Orientierung. Die DNA-bindende Konformation wurde aus Homologie-Modellierung und Disulfid-verbruckten Mutanten hergeleitet. Analytische Gelfiltrations-Chromatographie und kalorimetrische Messungen ermoglichten schlieslich ein Hampelmann-Modell fur die allosterische Induktion von YvoA abzuleiten, das zum ersten Mal einen Einblick in den Induktionsmechanismus eines Mitglieds der GntR/HutC erlaubt. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung der strukturellen Grundlagen der Aktivitatsumkehr bei TetR. Wahrend Wildtyp TetR an seine tet-Operatorsequenz in Abwesenheit von Tetracyclin bindet und von DNA bei Induktorbindung freigesetzt wird, bindet revTetR nur in Anwesenheit des Korepressors Anhydrotetracyclin (ATC) an DNA. Dennoch unterscheidet sich revTetR L17G von TetR einzig durch eine Mutation im Interdomanen-Interface zwischen der DNA-Bindedomane und dem Proteinkern. Das Protein wurde bezuglich der Effekte von Korepressor- und DNA-Bindung mittels Limitierter-Proteolyse-Assays und CD-Spektroskopie analysiert. Auserdem wurde die Kristallstruktur von revTetR L17G im Komplex mit ATC bei 1.74 A Auflosung gelost. Die Struktur und biochemische und biophysikalische Daten zeigten erstens, dass Effektor-freies homodimeres revTetR von vornherein nicht an DNA binden kann, weil die DNA-Bindekopfe partiell ungefaltet sind, zweitens, dass als Voraussetzung zur DNA-Bindung die Bindung des Korepressors einen Ubergang von ungeordnet zu geordnet induziert, und drittens, dass ein geschwachtes Interdomanen-Interface revTetR-[Mg-ATC]+ eine Justierung und Bindung an seine Operatorsequenz erlaubt. Diese Ergebnisse legen einen Mechanismus offen, der sich vom Induktionsmechanismus des Wildtyp TetRs vollstandig unterscheidet." @default.
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