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- W355745793 abstract "Ce memoire porte sur l’etude des activites enzymatiques de la mitochondrie de la levure Saccharomyces cerevisiae, responsables de la maturation en 5’ et en 3’ des tRNA realisee par la RNase P et la 3’ pre-tRNase, respectivement.La majeure partie de ce travail est consacree a la purification de la RNase P mitochondriale de levure et a l’etude de ses constituants ribonucleique et proteique. Puis, dans le cadre d’une etude des relations structure-fonctions du composant ribonucleique de la RNase P mitochondriale, nous avons identifie ce dernier dans les mitochondries de differentes levures du genre Kluyveromyces, evolutivement tres proches du genre Saccharomyces. Enfin, nous avons caracterise la 3’ pre-tRNase mitochondriale et etudie quelques-unes de ses proprietes.La RNase P est une ribonucleoproteine constituee du RNA 9S code par un gene mitochondriale (gene RPM1) et de proteine(s) codee(s) par le noyau. L’enzyme a ete purifie a une apparente homogeneite. Nous avons demontre que le RNA 9S est le composant ribonucleique de la RNase P. Cependant, des experiences d’hybridation “Northern” sur le RNA extrait a differentes etapes de la purification de l’enzyme, en utilisant des sondes de differentes regions du gene RPM1, ont montre que le RNA 9S etait degrade au cours de la purification, sans pour autant affecter de facon significative l’activite de l’enzyme. D’autre part, l’extraction du RNA a partir de la RNase P purifiee a permis d’isoler un RNA de 70 nucleotides dont la sequence correspond a celle de l’extremite 3’ du RNA 9S. La presence de ce fragment dans la ribonucleoproteine semble etre suffisante pour son activite in vitro. Un polypeptide de 63 kDa co-purifie avec l’activite RNase P. Il a une masse de 250 kDa sur gel natif, suggerant qu’il pourrait etre compose de 4 sous-unites du polypeptide de 63 kDa et d’un fragment du RNA 9S de 70 nucl. Le polypeptide de 63 kDa est revele avec des sera de malades atteints de maladies auto-immunes. Ces sera diriges contre des ribonucleoproteines, sont notamment capables de reconnaˆitre la RNase P de E. coli et de cellules Hela. Ainsi, le composant proteique de la RNAse P pourrait avoir des homologies structurales avec d’autres ribonucleoproteines reconnues par cette famille d’anticorps, comme par exemple la U1-snRNP et la thRNP(RNase MRP).Afin de preciser les relations structure-fonctions du RNA de la RNase P mitochondriale de levure, nous avons identifie des genes equivalents a celui du RNA 9S dans les mitochondries de differentes especes du genre Kluyveromyces (K. bulgaricus, K. fragilis, K. thermotolerans) et de S. carlsbergensis, evolutivement proches du genre Saccharomyces. Le gene de ce RNA de ces quatre especes a ete clone par PCR. Nous avons demontre que ce gene code effectivement pour le constituant ribonucleique de la RNase P. En effet, la presence du RNA correle parfaitement avec l’activite enzymatique de la RNase P dans des fractions mitochondriales partiellement purifiees. La taille et la sequence de ces RNA se sont revelees tres variables d’une espece a l’autre. Les seuls elements de sequences conservees sont localises dans deux courtes regions situees, l’une a l’extremite 5’ et l’autre a l’extremite 3’ de la molecule. Ces deux blocs qui representent les seuls elements de sequences conservees entre le RNA des eubacteries et celui des mitochondries de levures, sont capables de s’apparier pour former une structure en “pseudo-nœud”. Ce repliement tertiaire pourrait etre crucial pour la fonction de ces RNA. L’alignement des sequences de ces RNA mitochondriaux nous a permis de proposer un modele commun de structure secondaire, comparable a celui des RNA des RNAse P procaryotes.Nous avons caracterise l’activite endonucleasique impliquee dans la maturation de l’extremite 3’ des tRNA mitochondriaux. Contrairement a la RNase P mitochondriale, l’activite de cet enzyme ne depend pas de la presence d’un acide ribonucleique. Des etudes cinetiques de maturation, realisees avec un precurseur de tRNA possedant les deux extensions en 5’ et en 3’, ont permis de mettre en evidence l’existence d’une chronologie dans la maturation des tRNA mitochodriaux. En effet, dans des fractions proteiques contenant a la fois l’activite de la RNase P et celle de la 3’ pre-tRNase, les extremites 5’ sont enlevees en premier, puis dans un deuxieme temps, la 3’ pre-tRNase clive l’extension 3’ du precurseur. Malheureusement, la purification de la 3’ pre-tRNase a bute sur un probleme de stabilite de cet enzyme qui n’a donc pu etre etudie de facon plus approfondie." @default.
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