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• W656322375 abstract "La promiscuite des enzymes joue un role primordial pour l’evolution des proteines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les determinants moleculaires qui regissent cette promiscuite enzymatique represente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires evolutives pouvant entrainer l’emergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette these a consiste d’une part a sonder la promiscuite catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’interet biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part a etendre ses capacites naturelles par des techniques d’evolution moleculaire. Une trentaine de molecules ont ete testees et ont permis de mettre en evidence la forte specificite de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuite vers les substrats accepteurs. Le role des residus impliques dans la reconnaissance des substrats a par la suite ete considere au travers d’une strategie rationnelle basee sur des previsions de stabilite thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi ete ciblees par mutagenese a saturation. La stabilite de ces mutants a ete etudiee ainsi que ainsi que leur activite envers differents substrats. Des enzymes a la stabilite amelioree ou montrant des changements de specificite de produits ont ainsi ete identifiees. Afin d’etudier plus amplement la promiscuite de cette amylosaccharase, une deuxieme strategie d’ingenierie a ete menee pour mimer in vitro les mecanismes moleculaires de la derive genetique neutre. Ce phenomene dit de “Neutral-Drift” a prealablement ete decrit comme un facteur implique dans les changements de promiscuite catalytique. Quatre cycles de mutagenese ont ainsi ete realises et 440 clones ont ete selectionnes pour avoir conserve leur fonction originelle (i.e. leur activite sur saccharose). Des variants aux proprietes catalytiques ameliorees envers des substrats alternatifs ont ete caracterises et des groupes de positions correlees ont ete identifies. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilite a egalement ete etudie. Enfin, de facon remarquable, une nouvelle activite envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le methyl-α-L-rhamnopyranoside, a ete detectee. Ce variant possedant quatre substitutions a ete caracterise et la resolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant sequence, structure et activite de l’enzyme" @default.
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